Стимулятор эмбриогенеза в культуре растительной ткани

Стимулятор эмбриогенеза в культуре растительной ткани

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам культивирования растительной ткани и может быть использовано для нужд клеточной и генетической инженерии. Целью изобретения является ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных морфогенетических зон в культивируемой ткани. Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфениланином, добавляя его в питательную среду в концентрации 10-100 мг/л, применяя тем самым данное соединение в качестве стимулятора эмбриогенеза. Способ позволяет увеличить выход эмбриогенных морфогенетических зон на культивируемой ткани, а также получать большое количество эмбриондов и регенерантов уже в первом пассаже. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 44798 А1 (51) 5 С 12 N 5/00

06 ;нд3 с 11Ц .1С, г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А BTOPCH0MV СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4409464/31 — 13 (22) 12.04.88 (46) 23.02.90. Бюл. 11 - 7 (71) Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (72) О.В,Захленюк, И.А.Костенюк, В.А.Кунах, С.А.Рабинович и И.Н.Кузовкина (53) 631.522:58.083.5(088.8) (56) Сидоров В,А., Н.М., Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Соматическая гибридизация пасленовых. — Киев:

Наукова думка, 1985, с. 132 ° (54) СТИМУЛЯТОР ЭМБРИОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНОИ ТКАНИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам культиИзобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению эмбриоидов и регенерантов в культуре растительной ткани.

Объектами исследования служили культуры тканей табака (Nicotiana

tabacum) и мака прицветникового (Papaver Ъгассеагum Lindl) °

Культура тканей табака широко используется как модельный объект в различных направлениях селекционногенетической работы in vitro а также как продуцент ряда ценных веществ, в частности убихинона. Культура тканей мака прицветникового представляет собой перспективный источник морфиновых алкалоидов. В последнее время все большее внимание уделяется разработке способов выращивания культур

2 вирования растительной ткани и может быть использовано для нужд клеточной и генетической инженерии. Целью изобретения является ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенньж морфогенетических зон в культивируемой ткани. Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфенилаланином, добавляя его в питательную среду в концентрации 10-100 мг/л, применяя тем самым данное соединение в качестве стимулятора эмбриогенеза. Способ позволяет увеличить выход эмбриогенных морфогенетических зон на культивируемой ткани, а также получать боль- I шое количество эмбриоидов и регенерантов уже в первом пассаже. 2 табл. тканей — продуцентов ценных вторичных метаболитов, сохраняющих способность к морфогенезу. Так, в существующих ныне штаммах мака прицветникового спектр синтезируемых алкалоидов изменен в сторону бензофенантридиновых алкалоидов, а морфиновые, в частности тебаин, появляются лишь в эмбриоидах и регенерантах. Поэтому надежный и эффективный способ получения регенерантов важен для обоих видов.

Цель изобретения — ускорение эмбриогенеза и увеличение количества эмбриогенных зон в культивируемой ткани.

Способ состоит в том, что на культивируемые ткани растений воздействуют парафторфенилаланином, добавляя его в питательную среду в концент1544798

До 1 л

В среду добавляют дополнительно

60-. 100 мл/л парафторфенилаланина.

В качестве контроля выращивают ткань на питательной среде приведенного состава без добавления парафторфенилвланина. рации 10-100 мг/л. Это соединение является известным. Парафторфенилаланин используется как селективный фактор для поддержания пролиферации гаплоидных клеток в культурах тканей растений. Как стимулятор эмбриогенеза ранее он не применялся. Ткани предварительно выращивают в течение нескольких ростовых циклов на обычной питательной среде с добавлением парафторфенилаланина до их перевода на эмбриогенную среду, либо сразу переводят на эмбриогенную среду, содержащую парафторфенилаланин ° В течение 1-3 ростовых циклов отбирают эмбрибиды и регенеранты, укореняют их и высаживают в грунт или культивируют далее

in vitro.

Пример 1. Культуру тканей табака получают и выращивают на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, которой присвоен индекс

МС-2. Среду готовят так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг: 25

ЯН,NO, 550

""Оз 633,3

СаС1 .2Н20 146,3

М8$0, 7Н,О 123,3

КН РО4. 56,6

"ЗВОЗ 6 2

Мп$04 4Н 0 22, 3

СоС1 6Н О 0,025

Со$04 58>P 0,025

ZnSO4 7Н 20 8,6

Na ÌoO4 2Н О 0,25

KJ 0,83

FeSO4. 7Н20 27,8

Na2EDTA . 2Н О 37,3

Тиамин 0,4

Мезоинозит 80

Са-Пантотенат 5

Гидролизат каэеина 1000

d-Нафтилуксусная кислота 2

Индолилуксусная кислота 0,5

Кинетин 0,1

Сахароза 30000

Агар-агар 8000

Дистиллированная вода

Среду разливают в сахарные пробирки по 6 мл в каждую, автоклавируют

15 мин при 1 атм. После застывания среды ткань табака рассаживают по

0,3-0,4 r на пробирку. Через 30 сут ткань пересаживают на свежую среду.

После культивирования в течение

7 мес. ткань обоих вариантов переводят на эмбриогенную среду Т-3 и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освещения, освещенность 1800-2000 лк, температура 26 + 1 С).

Среду Т-3 готовят так, чтобы в

1 л ее содержалось, мг:

Кн ИО 550

633,3

СаС12 2Н 20 146,6

NgSO . 7Н20 123,3

КН РО4 56,6

3 3 6,2

Nn SO4 4Н 20 22,3

СоС1г 6Н О 0,025

CuSO4 5Н20 0,025

Zn SO4 . 7Н 0 8,6

Ка2МО04- 2н 20 . 0,25

KJ 0,83

Fe$O4 7Н20 27,8

Na2EDTA 2Н20 37,3

Тиамин 0,4

Мезоиноэит 80

Са-Пантотенат 5

Гидролиэат каэеина 1000

Индолилуксусная кислота 0,2

Кинетин 1,5

Сахароза 50000

Агар-агар 8000

Дистиллированная вода

До 1 л

Результаты анализа трех последовательных ростовых циклов на эмбриогенной среде представлены в табл. 1.

После выращивания тканей на среде, содержащей 100 мг/л парафторфенилаланина, предлагаемый способ превосходит известный по частоте регенерации (отношение субкультур с эмбриоидами к общему числу субкультур) в 1-м, 2-м и 3-м пассажах соответственно в

3 5; 3,3 и 2,7 раза. В среднем за три пассажа предлагаемый способ повышает частоту регенерации более чем в

3 раза по сравнению с контролем. Количество эмбриоидов и регенерантов на отдельную субкультуру опытного варианта намного превышало контрольное.

1544798

При более низких концентрациях (80 и 60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффекта не обнаружил.

Пример 2. Для выращивания культуры тканей мака прицветникового готовят модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга (индекс среды

PW) так, чтобы в 1 л ее содержалось, мг/л:

1

30000

8000

До1л

Среду разливают в пробирки по 5 мл в каждую. Стерилизуют 15 мин при

1 атм. После застывания среды ткань мака рассаживают по 0,3-0,5 г на пробирку и культивируют, пересаживая каж дые 15 сут на свежую среду.

Затем готовят эмбриогенную питательную среду как описано, исключая из ее состава 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и кинетин и добавляя пара

КН4ИОЗ

KNO

СаС1,, Мазо 7Н70

КН РО

Н ЗВоз

Ип50 4Н О

СоС1 6Н О

Cu SOq 5H О

ZnSO< .7НтО

Na МоО„. 2Н тО

KJ

Fe SO q. 7Н О

Na

Тиамин

Мезоинозит

Пиридоксин

Никотиновая кислота

Гидролиэат казеина

Глицин

2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота

Кинетин

Сахароза

Анар-агар

Дистиллированная вода

1650

1900

440

370

170

6,2

22,3

0,025

0,025

8,6

0,25

0,83

27,8

37,3

0,1

100

0,5

0,5

500

40 фторфенилаланин в концентрации 10

60 мг/л. Ткань мака со средним темпом роста в возрасте 15 сут переносят на эмбриогенную среду и выставляют на свет (12-часовой световой день, лампы дневного освешения, освещенность

1800-2000 лк, температура 26 + 1 С).

В качестве контроля выращивают ткань на указанной эмбриогеныой среде беэ добавления парафторфенилаланина. Результаты анализа двух последующих ростовых циклов представлены в табл.2 °

Как видно из приведенных данных, частота регенерации в опыте (при концентрации парафторфенилаланина

10 мг/л) в 1-м и 2-м пассажах была соответственно в 4,6 и 1,5 раза выше, чем в контроле. Предлагаемым способом удалось получить в 1-м пассаже в 4,9 раза больше, а во 2-м — в 2,4 раза больше эмбриоидов в расчете на каждую субкультуру по сравнению с контролем.

В среднем за два пассажа культивирования предлагаемый способ позволяет увеличить выход эмбриоидов на каждую субкультуру более чем в 3 раза по сравнению с контролем. При концентрации парафторфенилаланина 30 мг/л незначительный эффект стимуляции регенерации отмечен в первом пассаже. При более высокой концентрации (60 мг/л) парафторфенилаланин подобного эффек-, та не обнаружил.

Таким образом, предлагаемый способ гозволяет интенсифицировать процессы регенерации в культуре тканей табака и мака более чем в 3-4 раза. Оптимальными концентрациями парафторфенилаланина в укаэанных способах стимуляции регенерации являются: в культуре тканей табака 100 мг/л, в культуре тканей мака прицветникового 1О мг/л.

Формула изобретения

Применение парафторфенилаланина в качестве стимулятора эмбриогенеза в культуре растительных тканей.

1544798

Таблица 1

Число субкультур с эмбриоидами в среднем эа три пассажах, Х

Пассах

Число субкультур с эмбриоидами, Х

Вариант

20,0

30,0

30,0

2

26,6

70,0

100,0

80,0

100, 0

83,3 80,0

23,3

60,0

Таблица 2

Пассам

Вариант

0,647

1,929

11,8

57,1

Ткань на эмбрио- 0 генной среде .(известный способ) 1,226

10,0

3,960

54,5

85,7

3, 182

4,571

30,0

37,5

18,8

0 531

60,0

* Коэффициент эмбриогенеза рассчитывали как отношение учтенных эмбриоидов к общему числу субкультур данного варианта.

Составитель В.Демкин

Техред М,Дидык Корректор А.Обручар

Редактор Н.Яцола

Тирах 487 Подписное

Заказ 470

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.умгород, ул. Гагарина, 101

Ткань на эмбриогенной среде Т-3 после семи пассалей на среде MC-2 (известный способ) Ткань на эмбриогенной среде ТЗ после семи пассией на среде МС-2 с добавлением ПФФА

Ткань на эмбриогенной среде с добавлением

ПФФА

Концентрация

ПФФА, мг/л

Концентрация

ПФФА, мг/л

30,0

30,0

10,0

0

Число субкультур с эмбриоидами, Х

Коэффициент эмбриогенеза*

0,875

О, 188

Коэффициент эмбриогенеза (средний эа два пассажа)