Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной форме н-антигена человека
Иллюстрации
Показать всеРеферат
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS - продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МонАТ) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы Рз-Х63-Ад8653 с клетками селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) N 253Д. Клетки культивируют в среде PPMJ 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Частота пассивирования 2-3 сут кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МонАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс., в культуральной 1:256-1:512. МонАТ относятся к классу 1дМ, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСЛУБЛИК (19) (ll) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4452142/30-13 (22) 29.06.88 (46) 23.03.90. Бюл. Р 1) (7l) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Й.И.Дерюгина, Н,И.Дризе, Л.Н.Леменева, Е.Y..Ñàäîâíèêîâà, Г.А.Удалов, И.Л.Чертков, М.И.Лапенков и А.E.Íîñûðåâ (53) 578.085.23(088.8) (56) Наставление по применению гетероиммунной анти-Н козьей сыворотки диагностической жидкой для судебномедицинских целей. М3 СССР. Утв.
20.06.74.
Патент ГДР М 241852, кл. А 61 К 39/395, С 12 N 5/02, 1987, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК NHBOTHblX MUS MUSCULUSi ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ ФОРМЕ Н-АНТИГЕНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека. Целью изобИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животного Mus. musculus продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (51) 5 С 12 N 5/00 А 61 К 39/395
2 ретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus — продуцента высокоактивных и высокоспецифичных моноклональных антител (МОНАТ) для выявления мембраносвязанной формы Нантигена человека. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag8653 с клетками селезенки мышей линии
BALB/с, нммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. Депонирован под номером ВСКК(П) М 253D. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с 20Х эмбриональной телячьей сыворотки.
Частота пассирования 2-3 сут: кратность рассева 1:3-1:4. Стабильная продукция МОНАТ наблюдается в течение 2 пассажей на мьшах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет
1:256-1:512 тыс., в культуральной
1:256-1:512. МОНАТ относятся к классу 1 gM, они специфичны для Н-антигена в эритроцитах человека. MOHAT могут быть использованы в диагностических целях. 2 табл.
I (MOHAT) для выявления мембраносвязанной формы Н-антигена человека.
Штамм перевиваемых гибридных клеток мыши Mus. щизси1цз H-86/50 получают в результате слияния мьшиной миеломы РЗ-Х63 Ag8.653 с клетками селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON. При слиянии используют
1551738 полиэтиленгликоль мол. мас. 3000, соотношение миеломных клеток и спленоцитов было 1:3 при общем количестве
6 спленоцитов и клеток миеломы 450.10 и 160 10 соответственно. Селекцию неслившихся миеломных клеток проводят в среде, содержащей аминоптерин (НАТ-среда).
Штамм получен в результате 3-крат- lp ного клонирования методом лимитирующих разведений при 100 антителообразующих клеток в двух последних клонированиях.
Штамм H-86 /50 хранится в коллек- 15 ции перевиваемых клеточных линий позвоночных под номером ВСКК(П) Н" 253D и характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Культу- 20 ра состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату клеток с обычной для гибридных антителообразующих клеток морфологией.
Кариологические признаки, Карио- 25 тип соответствует Mus. musculus.Модельное число хромосом 93 с интервалом варьирования 87-94 ° С помощью С окрашивания выявляются большой и малый метацентрики и один большой акроцентрик.
Культуральные признаки. Среда для культивирования RPMI 1640 или ДМЕМ с 20/ эмбриональной телячьей сыворотки, 4 MY L-глютамина, l цирувата натрия, 2X HEPES-буФера, 5 10 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Характер роста — стационарная суспензия. Me— тод снятия — резиновым "полисменом".
Частота пассирования 2-3 сут. Крат- 40 ность рассева 1:3-1:4.
При введении мышам BALB/ñ предварительно обработанным пристаном (2-5) 10 клеток асцит образуется
6 через 9 — 14 сут. Стабильная продукция 45 антител наблюдается в течение 2 пассажей на мышах, титр антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в солевой среде с эритроцитами фенотипа 0 составляет 1:256-1:512 тыс,50 в культуральной 1:256-1:512.
Характеристика MOHAT. MOHAT продуцируемые штаммом H-86/50, выявляют
Н-антиген, связанный с мембраной эритроцитов в реакциях агглютинации на плоскости и солевой среде и реакции абсорбции-элюпии с образцами, содержащими эритропитьi c kl-антигеном.
MOHAT H-86/50 принадлежат к классу 1 gM.
Консервация клеток. Ерио защитная среда: 50 . среды, 40 . сыворотки, 10 : ДМCO.
Режим замораживания. Клетки в криозащитной среде помещают на сутки при о
-70 С, после чего переносят в жидкий азот, Выживаемость клеток при размораживании составляет 70-85 . от жизнеспособных клеток до замораживания.
Сведения о контаминации линии, Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружены. Вирусы «е тестированы.
Пример. Лктивность MOHAT
H-86/50 в серологических реакциях.
Образцы индуцированной клетками штамма асцитной и кондиционированной культуральной жидкостей исследовали по известным в серологии методам.
Титр и авидность антител определяли в реакции агглютинации на плоскости или в солевой среде (титр) в
96-ячеечных микроплатах. Под титром антител в реакции на плоскости или солевой среде подразумевали такое последнее их разведение, при котором крупные агглютинаты на плоскости начинали образовываться не позднее
30 с, а в ячейке наблюдали агрегаты эритроцитов. Под авидностью антител подразумевали сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам человека, оцениваемое в реакции агглютинации на плоскости с эритроцитами фенотипа 0 по времени появления первых агглютинатов (первый параметр), времени наступления четкой реакции агглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).
Титр и авидность анти-Н антител в реакции агглютинации на плоскости приведены в табл. 1, а титр в реакции агглютинации в солевой среде — в табл. 2.
Результаты, приведенные в табл.1 и 2, показывают, что МОНАТ H-86/50 как в культуральной жидкости, так и в реагенте, приготовленном путем разведения асцитной жидкости в 100 раз
0,3 М раствором хлористого натрия по отношению к эритроцитам фенотипа О, обладают гораздо более высокими титрами и авндностью по сравнению с гетероиммунными козьими анти-Н антисыворотками.
5 1551738
Т а б л и ц а
11родолжение табл. 2
Титр Авидность, с
Разведение
Антитела анти-Н
1:256-1:512
I:256
1:2 7-13-19
1:256
I:128-1:256
4-7-10
1-2-3
Таблица 2
Титр
Серия, уо
Антитела анти-H
Формула изобретения
Гетероиммунная сыворотка
20 1:2-1 3
108 I:2-1:4
79 l:4-1:8
Составитель А.1 аныкин
Редактор H.Ðîãóëè÷ Техред М.Дидык Корректор С.Черни
Тираж 500
Заказ 309 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул . Гагарина, 101
Гетероиммунная сыворотка, с.20
МОНАТ культуральная жидкость I:8
Н-86/50 асцитная жидкость 1:100 I:32
МОНАТ культуральная 1 жидкость 2
П-86/50 асцитная жидкость, разведение I 100 1
С помощьк. моноклонального анти-Н реагента, полученного на основе антител секретируемых гибридомой
H-86/50, можно надежно выявлять Нантиген на эритроцитах и, таким образом, устанавливать присутствие крови в объектах, подлежащих судебномедицинской экспертизе.
25 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus. musculus ВСКК(П)
li - 253D, используемый для получения моноклональных антител к мембраносвязанной форме Н-антигена человека.