Способ очистки щелочной фосфатазы

Способ очистки щелочной фосфатазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам очистки щелочной фосфатазы тонкого кишечника тюленя. Цель изобретения - повышение активности фермента . Раствор, содержащий фермент, хроматографируют на конканавалине А, иммобилизованном на сополимере оксиэтилметакрилата и зтилендиметакрилатэ. Сорбцию проводят раствором 20 мМ трис- HCI буфера рН 7,5, содержащего 0,4-0,6 М хлористый натрий, 1 мМ хлористый кальций, 1 мМ хлористый марганец и 1--20 мМ хлористый магний. Элюирование целевого продукта осуществляют той же буферной системой, дополнительно содержащей 50 мМ -метил-О-маннопирановид, с линейной скоростью 30-100 см/ч. Способ позволяет получать щелочную фосфатазу с удельной активностью 3000-3500 ед/мг белка. сл С

СОЮЗ СОВЕ I CKHX сОциАлистичегких

F ÃcïóÁëèê (51)5 С 12 N 9/16

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Irn (21) 4364063/13 (22) 14.01.88 (46) 07.11.92. Бюл. М 41 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной биохимии Научнопроизводственного объединения "Биолар"

АН СССР, Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов, Институт биохимии им.

А.Н.Баха и Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) И.Ю.Сахаров, И.E,Ìàêàðîâà, Э.А.Аренс, В.М.Лахтин и Г.А,Ермолин (56) Авторское свидетельство СССР

М 1218677, кл, С 12 N 9/16, 1984, Jasura S., Nagoka S. Jamashlta Т.

Namihlsha Т. — Comp. Biochem. Physlol. 1985, 8213, 4 рр.587-593.

Изобретение относится к получению очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохимических процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе.

Цель изобретения — повышение активности препарата щелочной фосфатазы.

Изобретение осуществляют следующим образом.

120 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 58-60 ед. на 1 мг белка, растворяют в 20 мМ трис-H Cl, р Н 7.4, содержащего 1-20 мМ М9С1г, 1 мМ СаС!2, 1 мМ. Ж 1554377 А1 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способам очистки щелочной фосфатазы тонкого кишечника тюленя. Цель изобретения — повышение активности фермента. Раствор, содержащий фермент, хроматографируют на конканавалине А, иммобилизованном на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата.

Сорбцию проводят раствором 20 мМ трисHCI буфера рН 7,5, содержащего 0,4-0,6 M хлористый натрий, 1 MM хлсристый кальций, 1 мМ хлористый марганец и 1-20 мМ хлористый магний. Эл оирование целевого продукта осуществляют той же буферной системой, дополнительно содержащей 50 мМ (-метил-D-маннопирановид, с линейной скоростью 30 — 100 см/ч. Способ позволяет получать щелочную фосфатазу с удельной активностью 3000 — 3500 ед/мг белка.

MnClz, 0,5 М NaCI, Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметилметакрилата, уравновешенную тем же буфером.

После отмывки колонки фермент элюируют стартовым буфером. дополнительно содержащим 50 мМ а-метил-D-маннопиранозида.

Все хроматографические процедуры проводят при 4 С. Скорость элюции 30 — 100 см/ч.

Активные фракции объединяют и определяют ферментативную активность по л-нитрофенилфосфату и концентрацию белка по

Лоури, Способ позволяет получить препараты щелочной фосфатаэы тюленя с удельной

55 а . тичног ьк . (.н»«м . 3300 3500 д/мг белка 11рименение в качестве полимерного носителя сополимера оксиэтилметакрилата и зтилендиметокрилата позволяет повысить с епень разделения смеси вероятно вследсгвие дополнительных различий в силе гидрофоб ных взаимОдействий матрицы носителя с присутсгвующими в разделяемои смеси белками и одновременно заметно увеличить линейную скорость элюции, что сокращает продолжительность хроматографического цикла и продолжительность воздействия инактивирующих факторов.

Верхняя граница скорости элюирования 100 см/ч обусловлена снижением степени очистки препарата, тогда как нижняя граница (30 см/ч) — снижением количества перерабатываемого сырья из-за увеличения продолжительности хроматографического цикла.

Неспецифическое связывание удается предотвратить в присутствии 0,4-0,6 NaCI, При понижении концентрации Na CI ниже

0,4 М наблюдается понижение удельной активности целевого продукта. Повышение концентрации Na CI в буферном растворе не приводит к какому-нибудь заметному улучшени о ка",ествл щелочной фосфатазы, Добавление 1-20 мМ М9С1з в элюатную

",истому при десорбции способствует стабилиз ции актив ой тетрамерной формы щеJ, оч нои 1>осфатаз ы тюле н R. Верхняя граница концентрации хлористого магния

20 м",Л обу ловлена с движением селективности разделения и уменьшгнием значения активно"ти ц-;левого продукта, нижняя гра:;ицз 1 мМ вЂ” уменьшением claáèëüíoñòè и активности фермента. Активность целевого продукта до 3360-3500 ед/мг белка, Пример 1, 120 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 58 ед/мг белка, растворяют в 40 мл 20 мМ трис-НСI, рН 7,4, содержащего 10 мМ MgCIz, 1 MM

МпС1г, 1 мМ СаС1г, 0,5 М NaCI (буфер А).

Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтиленметакрилата и этилендиметакрилата (26х94 мм), уравновешенную буфером А, и отмывают тем же буфером до Арво, равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ Q-метил-О-маннопиранозида.

Хроматографию проводят при 4 С. Скорость элюции — 50 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А беэ MnClz и СаС1 . Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 3500 ед/мг белка.

Пример 2. 15 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью 58 ед/мг белка растворяют в 5 мл 20 мМ трис-HCI, рН 7,4, содержащего 1 мМ MgClz, 1 MM МпС1, 1 мМ

СаС120,5 М NaCI (буфер Б). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (9х91 мм), уравновешенную буфером Б и отмывают тем же буфером до А280 0,01-0,03, Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ метил-D-ìaííonèðaíoýèда. Хроматографию проводят при 4 С.

Скорость элюции 30 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А без

MnClz и CaCI2. Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 3300 ед/мг белка.

Пример 3. 120 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью 58 ед/мг белка растворяют в 40 мл 20 MM трис-HCI, рН 7,4, содержащего 20 мМ MgClz, 1 мМ MnCIz, 1 мМ СаС4, 0,5 М NaCI (буфер С). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (26х94 мм), уравновешенную буфером С, и отмыьают тем же буфером до А во, равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ метил-0-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4 С. Скорость элюции 100 см/ч, Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А без MnClz u

CaCIz. Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 3370 ед/мг белка.

Пример 4. 15 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 60 ед/мг белка, растворяют в 5 мл 20 мМ трис-H CI, рН

7,4, содержащего 0,5 мМ М9С1г, 1 мМ MnClg, 1 мМ CaCIz, 0,5 М NaCI (буфер Г). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилиэованным на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (9х91 мм), уравновешенную буфером Г, и отмывают тем же буфером до Арво. равной 0,01-0,03, Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ а-метил-0-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4 С. Скорость элюции 25 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера без MnClz u CaCIg. Активманнопирэнозид в кпнцен р,1цин ог нуля по

0,2 M. Линейная скоросгь злюции 7,5 см/ч.

Получают препарат щелочной фосфатазы с удельной активностью 1500 ед/мг белка.

Способ позволяет получать активный препарат щелочной фосфатазы тюленя при сокращении продолжительности производительного цикла.

Составитель Е.Воробьева

Техред М.Моргентал Корректор Н.Гунько

Редактор Л.Павлова

Заказ 545 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород. ул.Гагарина. 101 ность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 2500 ед/мг белка.

Пример 5. 15 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью. равной 55 ед/мг 5 белка, растворяют в 5 мл 20 мМ трис-НС1, рН 7,4, содержащего 25 мМ MgCI>, 1 MM

МпС!г, 1 мМ CaCI2, 0,5 М NaCI (буфер Д).

Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А. иммобилизованном на 10 сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (9х91 мм), уравновешенную буфером Д и отмывают тем же буфером до

А во. равной 0.01 — 0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ а- 15 метил-D-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4 С, Скорость элюции

105 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера Д без МпС!г и CaClg. 20

Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 2450 ед/мг белка.

Пример 6, Препарат щелочной фосфатазы тюленя очищают в условиях способа-прототипа хроматографией на кон- 25 канавалине А, иммобилизованном на сефарозе. Для сорбирования фермента и промывки используют буферную систему:

20 мМ трис-HCI рН 7,5, 1 мМ CaClz, 1 мМ

MnClz, 0,9 NaCI и 0.05 тритона Х вЂ” 100. 30

Десорбцию и элюирование фермента осуществляют в той же буферной системе, дополнительно содержащей а-метил-РФормула изобретения

Способ очистки щелочной фосфатазы, предусматривающий хроматографию ферментного препарата из животных тканей на конканавалине А, иммобилизованном на полимерной матрице, при сорбции в буферной системе, содержащей 20 мМ трис-солянокислый буфер рН 7,5, хлористый натрий, 1мМ хлористый кальций и 1 мМ хлористый марганец, и элюировании целевого продукта той же буферной системой, дополнительно содержащей 50 мМ а-метил-О-маннопиранозид, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности фермента, используют ферментный препарат щелочной фосфатаэы из тонкого кишечника тюленя, в качестве полимерной матрицы берут сополимер оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата, в буферную систему для сорбции фермента дополнительно вводят 1-20 мМ хлористого магния, а хлористый натрий используют в концентрации 0,4 — 0,6 М, элюирование же осуществляют с линейной скоростью 30-100 см/ч.