Реактив для определения глицерина фотометрическим методом

Патент 1554765

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина и триглицеридов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение специфической активности. Для этого используется глицериноксидаза из ASPERGILLUS SPEC. ASM 1729.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.$0„„1554

I (l

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ IHHT СССР (21) 3285563/28-14 (22) 04.02.81 (31) Р 3004129.3 (32) 05.02.80 (33) DE (46) 30.03.90. Бюл. № 12 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Хельмгард Гауль, Ханс Зайдель, Гунтер Ланг, Альберт Редер и Иоахим Цигенхорн (DE) (53) 661.7 (088.8) (56) Патент ФРГ № 2817087, кл. С 12 D 13/10, 1980.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина триглицеридов в сыворотке крови.

Целью изобретения является реактив т включающий глицериноксидазу, характеризующейся более высокой специфической активностью.

Указанная цель достигается эа счет использования глицериноксидазы иэ Aspergillus Spec. DSM 1729 (микроорганизм почвы), которая была получена с молекулярным весом 90000 и специфической активностью между 2000 и 8000 Ч/мг, активность которой снижается под действием SH-реагентов, и на которую не влияет присутствие серно-кислой меди и уксусно-кислого свинца.

При определении триглицеридов вначале проводится их ферментативный гидролиз под действием липаэы и (У1) С 12 Р 7/20 // С 12 N 9/04

2 (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИЦЕРИНА ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ (57) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина и триглицеридов в сыворотке крови, Целью изобретения является повышение специфической активности. Для этого используется глицериноксидаза иэ Aspergillus Spec.

DSH 1729. эстераэы до глицерина и количество образовавшегося свободного глицерина определяют с помощью глицсриноксидазы, измеряя либо расход кислорода, либо количество перекиси водорода.

Потребление кислорода определяют поляриметрн чески с помощью кислородного электрода, реже используется газовая хроматография.

Перекись водорода может быть определена как титрованием, так и потенциометрическим, полярографическим и колориметрическим способами.

Предпочтительным способом является ферментативный способ с применением пероксидазы. При применении последней в качестве хромогенного вещества (красителя) используют соединения, которые после проведения реакции с фенолом могут быть определены фотоI метрически, например 2,2 -аминобензтиаэолинсульфокислота, 4-аминоантипирин, фенилендиаминсульфокислота

1554765

Для проведения определения 2 мл реактива 1 и 0,2 мл реактива 2 вводят пипеткой в кювету. Экстинкцию

Е измеряют на фотометре при 546 нм.

Непосредственно после этого инициируют реакцию добавлением 20 мкл пробы. Для определения глицерина н качестве пробы могут быть применены водные среды всех типов, например пищевые экстракты, содержащиеся н организме жидкости, и сыворотка.

После проведения реакции в течение 20 мин измеряют экстинкцию Е .

Температура выдержки составляет 5 О. ,, о

45 метилбензотиазолонгидраэон и буферный раствор. Кроме этих реагентов дополнительно реактив может содержать растворитель, стабилизатор и/или поверхностно-активные вещества.

Иредпочитаемыми поверхностно-активными средствами являются Генапол(9, алкилполигликоленый эфир, тритон® октилфенолокись полиэтилена

ГФ и Брий®, а также полиэтиленгликолевый эфир лаурилоного > стеарилоного и олеилового спирта.

При указанной величине рН 6,88,0 фермент имеет хорошую стойкость.

Предпочтительная комбинация реагентов состоит из

100-250 KV/ë (333-833 мг/л) глицерин оксидазы;

5-50 KV/ë (20-200 мг/л)

20 пероксидазы;

0,2-5 ммоль/л (38-955 мг/л) индикатора (4-антипирин аминозамещенный), 5-50 ммоль/л (64-6400 мг/л)

25 парахлорфенола;

1-5 г/л поверхностно-ак тивного вещества; рН 6,8-8,0 буферного раствора, Пример 1. Определение глицерина по образованию перекиси нодорода. Приготовляют два реактива.

Реактив 1.

О, 1 ммоль/л триэтаноламина (НС1-буфер, рН 8,0)", 2 г/л холата натрия (4,7 ммоль/л);

1150 мг/л парахлорфенола (10 ммоль/л);

86 мг/л аминозамещенного

4-аминоантипирина (0,5 ммоль/л), 40

40 мг/л пероксидазы (1О Ч/мл).

Реактив 2 ° 1600 мг/л глицериноксидазы (500 V/ми) .

П р и и е р 2. Кинетическое определение.

Проба. Водный стандартный раствор (содержание глицерина от 10 до

100 мг/дл).

Реактив ° 0,1 моль/л Pipes-буфера; 1,7 моль/н

Н hO, рН 7,0, 3,0 г/л холата натрия, 0,S ммоль вЂ” 90 мг/л аминоантипирина, аминозамещенного;

10,0 ммоль/л парахлорфенола (1170 мг/л), 10,0 Ч/л (40 мг/л) пероксидазы;

121,0 Ч/л

403 мг/л глицериноксидаэы.

Определение проводят на Gemsaec

Fast анализаторе-автомате: температура 25 С; длина волны при измерео,. киях 546 нм, объем пробы 10 мкл; разбанитель (Н О) 50 мкл, объем реактива 500 мкл. Время измерения: первое показание 35 с после начала, второе показание 315 с после начала °

Были получены следующие результаты:

Пробы (нодный стандартный раствор).

Глицерин (VV-тест), мг/дл

Значение глицерина-OD,X

101

Оценку производят по калибровочной прямой, на которой разность измеренных экстинкций бЕ = Е -Е стан 2 1 дартного глицеринового раствора находится в зависимости от концентрации глицерина.

Конечная концентрация в исследуемой смеси составляет:

45 Ч/мл вЂ” 144 мг/л глицериноксидазы;

9 V/èï вЂ” 36 мг/л пероксидазы;

0,45 ммоль/л-86 мг/л 4-антипирина аминозамещенного;

9 ммоль/л-1156 мг/л парахлорфенола;

4,3 ммоль/л-1800 мг/л холата натрия, рН 8,0 0,09 моль/л триэтаноламин/

/НО вЂ” буферный раствор

1554765 6

Получены следующие результаты.

Проба. Водный стандарт глицерина (45 мг/дл глицерина).

54 100

65 99

76 99

87 99

96 102

Пример 3. При кинетическом определении применяют реактив со следующим количественным соотношением компонентов: от 0,05 до

0,5 моль/л Pipes-буфера; от 0,5 до

2,0 моль/л Н БО ; рН от 6,8 до 8,0; от 1 до 5 г/л холата натрия, 0,25 ммоль/л (38-955 мг/л) 4-аминоантипирина, аминозамещенного, от 5 до

50 ммоль/л (640-6400 мг/л парахлорфенола, от 5 до 50 KV/ë (20-200 мг/л) пероксидазы, от 100 до 250 KV/ë (333-833 мг/л) глицериноксидазы.

Изобретение может быть осуществлено на автоматизированном анализаторе (спектрофотометре), имеющемся в биохимических лабораториях, Пример 4. Определение глицерина через образование Н О при применении различных аминоз

4-аминоантипирина. Осуще логично примеру 1, приче содержит различные амино

4-аминоантипнрин (0,5 мм

Получены следующие ре.

11роба. Водный стандар

45 мг/дл глицерина, Производное Нахо

4-аминоантипирина

Фенилендиаминсульфокислота

МВТП

О-МВТН

4-аминоантипирин (сравнение) 5

Нахождение вновь,7

IIoBepxHocTHo-активнее вещество

Ацетилтриметиламмоний бромид

Полиоксиэтилен лауриловый простой эфир (Вг13 35)

20 этокси-сорбитанмонолаурат (Твин 20)

10,5 этокси-нонилфенол (Тергитол NPX)

Тезит

Дезоксихолат натрия

Изотридеканол-полиглико20 левый простой эфир (Сепаро1 Х-80)

Холат натрия (сравнение)

Формула

101

103

97,5

101

99 изобретения амещенных Реактив для определения глицериствляют ана- на фотометрическим методом, содержам реактив 1 щий глицериноксидазу иэ рода Аврегзамещенные gillus, пероксидазу, индикатор, по1 оль/лi., 30 верхностно-активное вещество, буферзультаты: ный раствор, отличающийся т глицерина тем, что, с целью повышения специфической активности, îí содержит глиждение вновь,7 цериноксидазу иэ Аврегр111ов РБМ 1729, в качестве индикатора содержит 4-антипирин аминозамещенный и парахлорфенол, 35

102 в качестве поверхностно-активного ве101 щества холат или дезоксихолат натрия, 99 а буферный раствор с рН 6,8-8,0 при

40 следующем соотношении компонентов, г/л:

Глицериноксидаэа иэ рода Aspergillus 0,333-0,833

Пероксидаэа 0,02-0,20

4-Антипирин аминозамещенный 0,038-0 955

Парахлорфенол 0,640-6,400

Холат- или деэоксихолат натрия

Вуферный раствор рН 6,8-8,0 До1л

Составитель Л. Конюхова

Техред П.Сердюкова Корректор О, Кравцова

101

Пример 5, Кинетическое определение глицерина при применении различных поверхностно-активных веществ.

Осуществляют аналогично примеру

2, причем реактив вместо 3 г/л холата натрия содержит такое же количество другого поверхностно-активного вещества.

1,0-5,0

Редактор Ю. Середа

Заказ 467 Тираж 478 Подписное

ВНИЛПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

iiI:oèçволстненно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101