Способ проведения иммуноанализа

Способ проведения иммуноанализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа. Цель изобретения - увеличение чувствительности способа. Это достигается за счет того, что используются металлопорфирины, способные при ковалентном мечении белков резко увеличивать уровень замедленной флуоресценции, спектрально совпадающей с обычной флуоресценцией. Это дает возможность, возбуждая флуоресценцию металлопорфиринов в длинноволновой полосе поглощения и регистрируя свечение в той же спектральной области, минимизировать фоновое влияние фосфоресцирующих примесей, присутствующих в анализируемом образце и в материале кюветы. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 " 01 И 33/58

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЛ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4363876/28-14 (22) 14 01.88 (46) 30.04.90,,Бюл. ¹- 16 (71) Институт биохимии им,А.Н.Баха

АН СССР, Московский институт тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова, Государственный институт стандартизации и контроля лекарственных и бактерийных препаратов им.Л.А.Тарасевича и Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) Н.С,Осин, Н,В.Лепешкина, Д.Б.Папковский, В.Л.Румянцева, З.Б.Иткин, Г.В.Пономарев, А.П.Савицкий, В.Г.Петухов, А,Ф.Миронов и И.В.Березин (53) 612. 015 (088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 11446644008899, кл. G 01 N 33/54, 1988.

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа °

Указанная цель достигается тем, что в качестве люминесцирующих .металлопорфиринов используют металлопорфирины, обладающие свойством замедленной флуоресценции; при этом возбуждение светом проводят в длинноволновой полосе поглощения металлопорфиринов, а измерение уровня замедленной флуоресценции связавшегося металлопорфирина ведут в диапазоне длин волн максимума флуоресценции.

„„80„„1561042 А 1

2 (54) СПОСОБ ПРОВГЦВНИЯ ИММУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам проведения иммуноанализа, Цель изобретения— увеличение чувствительности способа. Это достигается за счет того, что используются металлопорфирины, способные при ковалентном мечении белков резко увеличивать уровень замедленной флуоресценции, спектрально совпадающей с обычной флуоресценцией.

Это дает возможность, возбуждая флуоресценцию металлопорфиринов в длинноволновой полосе поглощения и регистрируя свечение в той же спектральной области, минимизировать фоновое влияние фосфоресцирующих примесей, присутствующих в анализируемом образце и в материале кюветы. 1 табл. фивы

CA

CO

Пример . Исследуемую пробу с диагностируемым объектом — клетками Alcaligenus faecalis в концентрации 1 млн, микробных тел/мл обрабатывают гомологичными антителами к .Alcaligenus faecalis, приготовленными из сыворотки крови кролика. Антитела., мечены А1(ОН)-копропорфириномIII в соотношении белок/порфирин

1/1 (М). Параллельно проводят обра- 1Ь ботку исследуемой пробы гетерологич-ными антителами, меченными А1(ОП)копропорфирином. Обработку проводят добавлением в пробирки с пробой по 1мл гомологичных игетерологичных антител в концентрации 1 мкг/мл. Опытную и 156104? кой — 350 отк.ед. Числовое соотношение опыт/контроль 1300/350 равко 3,7.

Пример 2. В лунки полисти5 рольного микропланшета для иммуноферментного анализа (Dynatech, CIIIA) адсорбируют антитела к определяемому актигеку: заливают в кажпую лунку по 0,2 мл актител (10 мкг/мл в 0,1 И карбокатном буфере, рН 9,1), инкубио о руют 1 ч при 37.С и ночь при 4 С, Затем раствор сливают и промывают лунки буфером ФСБТ (физраствор, рН

7,4, содержащий 0,1Е тритона Х-100) .

Заливают в 2 ряда лунок (опыт и контроль) по 0,2 мл стандартных раст воров антигена из Pseudomonas auroginosa (1; 0 5; 0 25; 0 12; 0 06;

0 мкг/мл) и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, Затем сливают растворы, промывают лунки 3 раза ФСБТ, заливают во нсе лунки 1 ряда антитела, ме1ченные А1(ОН)-копропорфирином (20 мкг/мл в ФСБТ), а в лунки второго

25 ряда — антитела, меченные Pd †копропорфирином (20 мкг/мл). После 1-часовой инкубации при 37 С растворы сливают, промывают лунки ФСБТ, заливают по 0,2 мл десорбирующего раствора (3 мМ ЦТАБ), Затем добавляют в лунки кислородсвязывающий агент сульфит натрия (5 мг/мл), переносят растворы н измерительные кюветы на

0,5 мл и регистрируют замедленную флуоресценцию Al(0H)-копропорфирика и фосфоресценцию Pd-копропорфирина н условиях, описанных и примере.1. Результаты приведены в таблице. Чувствительность способа — 0,12 мкг/мл, . вьппе, чем чувствительность способапрототипа (0,25 кг/мл).

t Г

0,5 0,25 0,12

Концентрация актигека 1 г0,06 0

Сигнал: Прецлагаемый способ

Прототип

2000

300 110 50

800 600 450

35 30

400 400 формула изобретения Способ проведения иммуноанализа шутем получения ангител или антиге.нов, меченных люминесцирующими соединениями, проведения иммунохимической реакции и детекции специЬического

Связывания по люминесценции меченого

Соединения, отличающийся

teM, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве люминесцируюших соединений используют контрольную пробирки затем освобождают от неснязавшихся меченых антител ц нтрифугировакием при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадок сливают, а осадок промывают изотоническим раствором, повторяя операцию центрифугирования, и ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем дополнительно н раствор внодят кислородсвяэывающий реагент †сульфит натрия в концентрации 3 мг/мл.

Параллельно проводят акалогичныи эксперимент, в котором используют гомологичные и гетерологичные антитела, меченные Pd (2+)-копропорфирин6м (прототип).

Регистрацию уровня сигнала опытной и контрольной проб осуществляют н спектрофлуориметре LS-5 фирмы

Рerkin Flmer. Временная задержка между актом возбуждения и приемом излучения - 1 мс, ! а) Режим измерения замедленной д пуоресценции Al (OH) -копропорфирина: длина волны возбуждения 570 нм (длин-! новолновая полоса поглощения); регистрация при длине волны 578 нм.

П евьппепие сигнала опытной пробы (l380 отн.ед.) над контрольной (40 отн.ед.) в 9,5 раз свидетельствует о наличии определяемого микроорганизма в пробе, б) Регистрацию фосфоресценции Pd (2+)-копропорфирина (прототип) при длине волны 670 нм осуществляют при возбуждении светом с длиной волны

395 нм (полоса Сорэ). Сигнал опытной пробы 1300 отн,ед., контрольI металлопорфирикы, обладающие свойстзамедленной Ьлуоресцекции, буждение светом проводят в цлинноволновой 06 -полосе поглощения металлопорфирина, а измерение уронкя замедленной флуоресценции ведут н диапазоне длин волн флурресценции металлопорфирина, при этом задержка между возбуждением и измерением уровня замедленной флуоресцеиции эквивалентна времени ее затухания.