Способ культивирования вируса гриппа

Способ культивирования вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, точнее к производству вирусных препаратов. Целью изобретения является снижение количества дефектных интерферирующих частиц в вирусной популяции, повышение ее инфекционной активности и улучшение тем самым качества вирусных препаратов. Для этого вируссодержащую аллантоисную жидкость каждого разведения всех циклов контролируют в реакции гемагглютинации (РГА). При этом в каждом последующем цикле пассирования развивающиеся куриные эмбрионы заражают вируссодержащей аллантоисной жидкостью (ВАЖ) с отрицательной и/или положительной РГА при минимальной инфекционной активности предшествующей заражающей дозы. Длительность циклов пассирования при этом устанавливают для проб ВАЖ с положительной РГА в 7-10 ч и проб ВАЖ с отрицательной РГА в 18-24 ч. 7 табл.

СОЮЗ COBETGHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

КСПУВЛИН

: (51) 5 С 12 Н 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

, (21) 4455101/30-13 (22) 05. 07. 88 (46) 15. 05.90. Бюл. 1! - 18 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) Э,Г. Лукьянова, H.H. Соколов и М.Л. Филиппова (53) 6!5,371 578.832 (088.8) (56) Регламент производства вакцины гриппозной инактивированной жидкой типа А, очищенной и концентрированной градиентным центрифугированием

Р 130-79. Утвержден 25.05.1979.

Коневская И.З. Пути усовершенствования технологии производства живой гриппозной вакцины. Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Л, 1972. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА

ГРИППА (57) Изобретение относится к медицинской вирусологии, точнее к проИзобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к производству вирусных препаратов.

Однако целевой продукт, получае-; мый этим способом, обладает низкой; инфекционной активностью.

Целью изобретения является снижение количества дефектных интерферирующих частиц в вирусной популяции, повышение ее инфекционной активности и улучшение тем самым качества вирусного препарата.

Пример ). Получение биомассы вакционного штамма вируса гриппа А/Ленинград/0139/76/H382/, „.SU, ß64185 А 1

2 изводству вирусных препаратов. Целью изобретения является снижение коли-, чества дефектных интерферирующих частиц в вирусной популяции, повышение ее инфекционной активности и улучшение тем самым: качества вирусных препаратов. Для этого вируссодержащую аллантоисную жидкость каждого раз .едения всех циклов контролируют в реакции гемагглютинации (РГА 1. При этом в каждом последующем цикле пассир :вания развивающиеся куриные эмб- рионы заражают вируссодержащей аллантоисной жидкостью (RAP() с отрицательной и/или положительной РГА при минимальной инфекционной активности предшествующей заражающей дозы. Длительность циклов пассирования при этом устанавливают для проб ВАЖ с ,положительной РГА в 7-10 ч и проб ВАЖ с отрицательной РГА в 18-24 ч. 7 табл., I пассаж на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Десятикратные развеleaL дения маточного вируса в объеме 2 мл QO делают на забуференном физиологичес- (,Д ком растворе рН 7,2, в который добавляют 0,01 М сернокислого магния и мономицин до концентрации 500 мкг/мп.

Каждым разведением вируссодержащей жидкости в объеме 0,2 мп заражают по четыре 10-11-дневных РКЭ и инкубиру- д, ют при 36 С в течение 18 ч. О наличии размножившегося вируса судят по результатам реакции гемагглютинации (РГА 1 с 1Ж куриными эритроцитами. Инфекционную активность Вируса (ЭИД О

1564185

/0,2 мл) рассчитывают по результатам ГА методом Кербера в моцификации, Ашмарина, после чего вычисляют дозы заражения, соответствующие использованным разведениям вируса Резуль5 таты титров ания прив едены в табл ° 1 .

Для последующего пассажа раздельно собирают вируссодержащую аллантоисЙую жидкость (ВАЖ) из РКЭ, зараженных последним разведением, обеспечивающим учитываемую репроцукцию вируса (10 ), а также ВАЖ с отрицательНой РГА (разведения исходного материала 10 и 10 )

ТТ пассаж на РКЭ. Отобранные 3 образца ВАЖ разводят с шагом 10 физиологическим раствором, содержащим указанные добавки. 0,2 мл каждого разведения заражают 3 параллельные пар- 20 тии РКЭ, которые инкубируют в течение о

20 ч при 36 С. Далее определяют нали-> чие вируса в РГА. Результаты приведены в табл.2. для последующего пассажа раздель- 25 но собирают ВАЖ из РКЭ, зараженных разведением, которая при наименьшем содержании вирусных частиц обеспечивает репродукцию в;руса определяемую в РГА. Таковым материалом является ВАЖ, полученная после заражения в I пассаже дозой 0,003. Для III пассажа

- > отбирают ВАЖ из 1>азведений ряда: 10

10, 10 и 10 (первое из этих разведений является минимальным с

35 положительной РГА, а остальные характеризуются отрицательной РГА).

III пассаж на РКЭ. Отобранные

4 образца ВАЖ разводят с шагом 10 указанным раствором. 0,2 мл каждого разведения заражают 4 параллельные партии РКЭ, которые инкубируют в тео чение 22 ч при 36 С. Затем определяют наличие вируса в РГА. Результаты представлены в табл.3.

В качестве посевного материала для накопления вируса используют вирус III пассажа, полученный в результате . заражения наименьшей дозой, еще обеспечивающей репродукцию вируса, определяемого эО в РГА.Таковым материалом является

ВАЖ, полученная после заражения дозой 0 уб ЭИД /Оу2 мле

so

Накопление вируса. Посевной материал помещают в холодильник при о 55

+4 С на 18 ч. Этот срок необходим в используемом в данном примере варианте заражения РКЭ на стадии накопления вируса наперед заданной дозой

/ (возможен вариант проведения стадии накопления без определения заражающей дозы), В период хранения ВАЖ в холодильнике производят титрование ее пробы дпя установления инфекционной активности. В данном примере посевной вирус, используемый для "накопления имеет инфекционную активность 10

ЭИД в 0,2 мл.

Для накопления вируса партию 10-!

1-дневных РКЭ заражают дозой 10 .1ИД,/0,2 мл и инкубируют в течение

24 ч при 36 С. Получают целевой продукт — ВАЖ с инфекционной активностью

1о, 5

10 ЭИД,/0,2 мл и обратным титром в РГА 51 2 . Индекс ИА/ГА = 1 0 : 51 2=

10 «3

Контроль. Для контроля пассирование данного вируса проводят 3-кратно

) при той же-температуре и экспозиции по

48 ч с использованием заражающей дозы

1-3 ЭИД /0,2 мл с последующим,накоплением вируса в том же режиме при заражающей дозе 1О ЭИД /0,2 мл. Получают ВАЖ с инфекционной активностью

10 и обратным титром в РГА 2048.

9о

ИА/ГА = 10:2048 = 10 что существенно ниже, чем в предлагаемом способе.

Для контроля проводят также седиментационный анализ целевых продуктов, полученных по прототипу и по данному примеру. Вирусная популяция, полученная по прототипу, гетерогенна.

Вирусная популяция, полученная предлагаемым способом, гомогенна и состоит из стандартного (инфекционного) вируса, т.е. вируса, не содержащего ДИЧ.

Пример 2. Полученные биомассы вакционного штамма вируса гриппа

А/Техас/1/77а/H3N2/.

Маточный лиофилизированный вирус указанного штамма трехкратно пассируют на РКЭ при кратности разведений заражающего материала с шагом 10, Для последующих заражений при пассировании отбирают ВАЖ ближайших двух разведений с отрицательной РГА после разведения, использование которого давало положительную РГА (как описано в примере 1). Пассирование проводят при температуре 35 С и экспозициях 18, 20 и 24 ч (заявляемый режим экспозиции), а также 16 и 30 ч (запре дельные режимы).

Стадию накопления вируса проводят о при 35 С в течение 20 ч с использованием заражающей дозы 100 ЭИЩ,> /0,2мл. бирают BNK нз эмбрионов, еще содержащих вирус по данным РГА в последнем разведении . Эту ВАМ используют в качестве посевного материала на стадии накопления вируса. Ей соответствует доза заражения предшествующего разведения 0,01 ЭИД, /0,2 мл.

В данном примере для Ш пассажа используют в качестве эаражакицего матержла ВАЖ ?Т пассажа с положительной РГА при минимальной дозе заражения в укаэанном пассаже. Поэтому экспозицию III пассажа устанавливают равной 8 ч.

В качестве посевного материала для накопления вируса используют ВАЖ

III пассажа, полученную в результате заражения дозоЯ, еще обеспечивающей репродукцию вируса, учитываемую в РГА.

Стадию накопления вируса проводят как в примере I. Получают целевой продукт с инфекционной активностью ИА

10 ЭИД /О 2 мл и ГА = 512 Следовательно > 1g (ИА:ГА) = 10,8— — lg512 = 8,1.

В табл.? приведены сравнительные данные технических характеристик целевых продуктов, полученных по предлагаемому способу и прототипу. Эти данные систематизированы по результатам 50 испытаний каждого из способов на указанных штаммах вируса гриппа.

При этом для предлагаемого способа обобщены выходные данные различных режимов его осуществления.

Фо рм ул а и s о б р е т е н и я

Способ культивирования вируса гриппа путем многоциклового пассиронания, вычисления инфекционной активности вируса и .последующего на45 копления вируса в развивающихся куриных эмбрионах, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью снижения количества дефектных интерферирующих частиц н вирусной популяции и поньппе50 ния ее инфекционной активности, в каждом последующем цикле пассиронания эмбрионы заражают вируссодержащей аллантоисной жидкостью предыдущего цикла, имеющей отрицательную и/или поло55 жительную реакцию гемагглютинации при минимальной инфекционной активности, при этом при использовании вируссодержащей аллантоисной жидкости с положительной реакцией гемагглю$ 156418$ 6

Получают целевые продукты (ВАЛ1) с характеристиками, указанными в табл.4.

Как видно из табл.3 наибольшая степень обогащения ВАЖ инфекционным вирусом имеет место при экспозиции v

18-24 ч. В этом режиме наблюдается резкий максимум удельной активности (ИА:ГА), что свидетельствуето повй1О шенин качества целевого продукта. . Пример 3.. Получение биомассы вакциониого штамма вируса гриппа

А/Техас/1/77а/H3N2/ в зависимости от числа пассажей.

Маточный лиофилизированный вирус указанного. штамма пассируют на РКЭ при 35 С, экспозиция 20 ч ° Стадию накопления вируса проводят, как описано в примере 2, после 1,2,3 и 4 пас- 20 сажей. Результаты контроля полученной

ВАЖ приведены в табл.5 (отбор материала для последующего пассирования производили, как в примере 2).

Из табл.5 видно, что одного пасса- 25 жа недостаточно для обеспечения высокого качества целевого продукта.

Пример 4. Маточный лиофилизиронанный вирус гриппа штамма

А/Техас/1/7?а/H3N2/ двухкратно пассируют при 35 С и экспозициях 7,8 и

10 ч (предлагаемый режим) и 5 и 14 ч (запредельные режимы). Во 2-ом цикле пассиронания РКЭ заражают ВАЖ с положительной РГА при минимальной дозе

35 заражения эмбрионон предыдущего цикла (10 ЭИД,/0,2 мл) ° После II пассажа собирают ВАЖ из эмбрионов, еще содержащих вирус по данным РГА в последнем разведении. Эта ВАЖ является посевным материалом для стадии накопления вируса.

Стадию накопления вируса проводят как в примере 2.

ВАЖ отбирают. Получают целевой продукт с характеристиками, приведенными н табл.б.

Как видно из табл.б, только в предлагаемом режиме достигается высокое качество целевого продукта по показателю удельной активности.

Пример 5. Маточный лиофилизированный вирус гриппа штамма А/Техас/

/1/77а/H3N2/ пассируют при 35 С в течение 8 ч. Для второго пассажа отбирают ВАЖ с отрицательной РГА при дозе заражения 0,1 и 0,01 ЭИД /0,2 мл

Второй пассаж проводят инкубированием в течение 20 ч. После II пассажа со,1564185 тинации цикл пассирования устанавливают в 7...10 ч, а при использовании вируссодержа1цей аллантоисной жидкоса б л и ц а 1

«

«. - «>ь«.„, Разведение ви1.- а

0 )0 10 10

ЭИД„ 0,2 исходного м:териала

Показатель

10 1

10-3

5I2 256 256 32

Доза заражения

3162 316 32 3

0,3 0,03 0,003

Таблица2

Доза получения за ражающег материал

I пассаж

Разведение вируса

ЭИД1. /0,2 мл заражающего материала 1 пассажа

Показ атег..

I0 1 10

0-1

0,31

Число эмбрионов в которых обнаружен вирус в

РГА

Обр. титр в РГА

Доза заражения

Обнаружен вирус в РГА

Обр. титр

Дбза заражения

Обнаружен вирус в РГА

Обр. титр

Дбза заражения

1024 512 1024

5623 562 56 5,6 0,6 0,06 0,006

0,03

2 0 2 0 О

1,8 0,2 0,02 0,002 0,0002

О О О 0 0

177 18

О, 003

I0I

0,1

0>0) 0,001 0,0001

1 (ТаблицаЗ

ЭИД /0,2 мп заражающего материала II пассажа

Разведение вируса

Доза полу чения заражающего материала

II пассажа

Показатели

10- 10 1 10 1 10

10 з

10 -1

10-з

10, г

3 3 1 1 4 4 3

I,0

Эмбрионы с обнаруженным вирусом

Обр ° титр в

РГА

Доза заражения

256 ° . 64 16 16 256 32 32

18 тыс. 1780 178 18 1>8 0,2 0,02 0>002

Число эмбрионов, в которых обнаружен вирус в

РГА

Обратный титр вируса в РГА ти с отрицательной реакцией гемаггюпотинации цикл пассирования устанавливают. в 18...24 ч.

10-> 10- 10-> 1О- 10-

1564185 !

ЭИД /0,2 мл

S ap8%8N щего мате риала П пассаж&

Разведение -вируса

Доза получения за- Показатели

1 l!

О- 10- 10 10-г ражающего материала

II nacca0,l

Эмбрионы с обнаруженным вирусом

1 00 1 0 1 О, 1 О, О! 0,001 О, 0001

Oi0l

2 О

1 1 1

2 3

l О, I О, 01 О, 001 О, 000!

100 10

О, 001

l0! rS

0 О О

3 2

128 128

Таблица4

Таблица5

lg

ИА: ГА

А, бр. итр

Экспо- ИА, зиция, ЭИД /О, 2 ч

Число ИА, ГА, Lg пасса- ЭИД,/0,2 MJI обр.титр (H/1,;ГА) жей

10"

10 6

101î

10 "&

109,5

64 5,2

256 7,2

256 7,6

512 7,3

2048 6,2

16

18

20 .24

3

1 0

10,1

10"

10 !06

128 6,3

256 7,3

256 7,6

512 7,8

Таблица 6

Экспо- ИА, ц, ЭИд /о,г

ГА, обр. lg титр ИА:ГА

Не определяется

10 Э,т

8

512

512

512

1024

7,4 U

7,6

7,6

6,7

Обр,титр в

РГА

Доза заражения

Эмбрионы с обнаруженным вирусом

Обр.титр в

РГА

До з а э ар ажения

Эмбрионы с обнаруженным вирусом

Обр.,тигр в

РГА

Доза заражения

1 1 2 1 2 2

16 !6 128 16 128 256

128 256 128 - — 16

5, 6 0,6 0,06 0>006 0,0006 0,00006

ПРоцол!кение аул. 3

1564185

Таблица7

Характеристика

Прототип

Инфекционная активно сть

1g 10,2 0,04 7,5 0,04

ЭИД,/О, 2

1-;тт

Обр, 576+55 480Ф46

THЪ Э

7,4

4,8

Состав итель С . Св етлышев

Т ехр ед Л. Олий нык

КоРРектоР С. Шевкун

Редактор Л. Веселовская

Заказ 1139 Тираж 478 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Гемагглютинирующая активность

ИА: ГА .

Единицы . измерения

Предлагаемый способ