Способ определения специфической антителсвязывающей активности аллергоида

Способ определения специфической антителсвязывающей активности аллергоида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в производстве аллергоидов из пыльцы растений для контроля их качества и стандартизации. Цель - упрощение способа. Для этого используют реакцию связывания антител специфической сыворотки (классов G и M) с депонированным аллергоидом в соотношении 1,0:0,5-0,7 (мл). При снижении титра иммунной сыворотки в 4-512 раз от исходного по данным реакции непрямой гемагглютинации устанавливают наличие у депонированного аллергоида специфической активности.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1564552 дц Л 01 N 33/531

I t

Бг 3ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4180099/28-14 (22) 13,01.87 (46) 15,05.90. Бюл. N - 18 (71) Ставропольский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (72) И.А.Криволапова, Н,И,Воронкин, Б.Н.Райкис и О,А.Камбург (53). 615.373 (088.8) (56) Poulsen L.Ê., Weeke В. Aluminium hydroxide absorbed allergens

used in modified HdHt. — Allergy, 1985, 40, У 6, р.р. 405-416, Изобретение относится к медицине и может быть использовано в произ- водстве аллергоидов из пыльцы растений для контроля их качества и стандартизации, Цель изобретения — повышение точности способа определения специфической активности депонированного аллергоида за счет одновременного выявления степени связывания иммуноглобулинов, .

Способ осуществляют следующим образом, Для постановки реакции готовят ингредиенты;

1 ° Депонированный аллергоид — готовая форма, аллергенного препарата, представляющего собой взвесь сорби2 (54) спосоБ опркдклкния спкцифичкской АнтитклсВязБ!ВАющкй АктиВности

АЛЛКР ГОИДА (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в производстве аллергоидов из пыльцы растений для контроля их качества и стандартизации. Цель — упрощение спо соба. Для этого используют реакцию связывания антителспецифической сыворотки (классов G и М) с депонированным аллергоидом в соотношении

1,0:(0,5-.0.7) мл, При снижении титра иммунной сыворотки в 4-512 раз от исходного по данным реакции непрямой гемагглютинации устанавливают наличие у депонированного аллергоида специфической активности. рованного на Ь-тирозине формалинизированного аллергена, который перед работой тщательно взбалтывают.

2, Контрольный образец . †. взвесь

L-тирозина, не содержащая антиген. .t

В пробирку вносят 3 мл фосфатного буферного раствора рН вЂ” 7,0, добавляют 1,25 мл 247-ного раствора L-ти. розина в 3,8N растворе НС1 и 1,25 мл

3,2N раствора NaOH. Устанавливают рН взвеси 5,0 — 6,0, перемешивают и выдерживают 2 ч при +4 С. Затем взвесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин., надосадок удаляют а осадок дважды отмывают 5 мл фосфатного буфера, рН 5,5 — 6,0, После промывки осадок ресуспендируют 5 мл этого же буфера для последующего ис 1564552 пользования в качестйе контрольного образца, 3. Специфическая иммунная сыворотка, которую получают от больных, 5 страдающих поллинозом, вызванным данным видом пыльцы (амброзии, ежи и т.д,), или путем иммунизации кроликов породы Шиншилла пыльцой того же вида растения по следующей схеме: первую инъекцию — 57.-ную взвесь пыльцы, например, амброзии в полном адъюванте Фрейнда вводят по 0,6 мл подкожно и 0,6 мл внутримышечно каждому кролику и далее с интервалом

7 дней делают вторую и третью инъекции в таких .же дозах, как .и первую, На 14-й день после третьей инъекции делают пробный забор крови из ушной вены для определения титра в РНГА, При получении титра 1:640 проводят тотальное кровопускание. Б случае, если после 1 цикла иммунизации титры гемагглютинирующих антител окажутся ниже,чем 1:640, цикл иммунизации повторяют через 45 дней, после третьей инъекции.

При получении .сывороток, с титром

1:640 — 1:10240 их разливают в ампулы по 1 мл и лиофилизируют по известному режиму для сывороточных препаратов, Перед употреблением сыворотку в каждой ампуле разводят в 1 мл дистиллированной воды, Как.сыворотка пациента, так и разведенная кроличья сыворотка, используемые в данном способе, должны иметь титр в

РНГА 1:320 и вышее, Специфическую антителосвязывающую активность депонированного аллергои- 4п да определяют следующим образом: берут 2 пробирки, в одну из которых вносят 1 мп депонированного аллергоида, а в другую — 1 мл контрольного образца, Испытуемую и контрольную пробирки центрифугируют в течение

15 мин при 2000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают, а к осадкам в обе пробирки добавляют по

0,5-0,7 мл соответствующей специфи.ческой сыворотки, перемешивают и оставляют на 18 ч при комнатной температуре для связывания антител. По истечении времени инкубации пробирки центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин, надосадочную сыворо ку с каждого об-. разца сливают и определяют в каждом из них титр антител в РНГА, Параллельно определяют в РНГА титр антител в исходной специфической сыворотке, не подвергнутой инкубации, Учетным считают титр антител в той лунке каждого ряда, где еще определяется гемагглютинация на

lip qq H

Определив титры антител в исходной сыворотке, сьворотке, инкубированной с контрольным образцом, и сыворотке, инкубированной с депонированным аллергоидом, сопоставляют полученные результаты. При этом титр сьворотки, инкубированной с контрольным образцом, должен совпадать с титром исходной сыворотки, что является доказательством отсутствия неспецифической сорбции антител на депонаторе L-тирозине (допускается снижение титра сыворотки, инкубированной с контрольным образцом, в 2 раза от исходного,,что может быть погрешностью РНГА), Далее сопоставляют с титром исходной сьворотки титр сыворотки, инкубированной с опытным образцом-депонированным аллергоидом, При этом если депонированный аллергоид обладает специфической активностью, то происходит одновременное связывание его с гемагглютинирующими антителами, представленными IgL и IgN, что выражается снижением титра сыворотки в опыте в 4-512 раз в

РНГА, Пример 1. В опытную пробирку вносят 1 мл сорбированного íà L-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии, а в. контрольную пробирку — 1 мл контрольного образца взвеси L-тирозина, не содержащей антигена амброзии. Пробирки центрифугируют 15 мин при

2000 об/мин, затем надосадочную жидкость сливают, а к осадкам в обе пробирки добавляют по 0,5 мл специфической к пыльце амброзии гипериммунной кроличьей сыворотки, содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение

18.ч. Затем пробирки центрифугируют

15 мин при 2000 об/мин, надосадочную сыворотку с образцов сливают и определяют титр гемагглютинирующих антител в РНГА. Параллельно ставят РНГА с исходной неинкубированной сывороткой, При этом получают титр сьворотки, инкубированной с контрольным образцом, равный 1:1280, титр исходной неинкубированной сыворотки—

1:1280, титр сыворотки, инкубирован1564552 6.5

Составитель Н,Калинин

Техред Л.Олийнык Корректор Л.Бескид

Редактор М.Циткина

Тираж 508 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР. 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1157

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 ной с делонированным аллергоидом амброзии, — 1: 320. Показатель снижения титра антител — 4 раза при отсутствии неспецифической сорбции антител на сорбенте. Способность испытуемой серии сорбированного íà L-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии связывается со специфическими противоамброзийными гемагглютинирующими антителами, представленными иммуноглобулинами не менее чем двух классов (L,М), свидетельствует о наличии специфической активности представленных в препарате антигенных дегерминант, следовательно, данная серия препарата может быть выпущена для лечения амброзийного полиноза.

Пример 2. Способ определения специфической активности депонированного аллергоида ведут так же, как в примере 1, за исключением того, что берут сорбированный íà Lтирозине аллергоид из пыльцы ежи сборной (другого вида растения) и соответствующую специфическую к пыльце ежи гипериммунную кроличью сыворотку, При этом получают титр сыворотки, инкубированной с контрольным ббразцом, 1:10240, титр исходной неинкубированной сыворотки — 1:10240, титр сыворотки, инкубированной с опытным образцом, — 1:20, Показатель снижения титра 512 раз, Исследуемая серия препарата обладает выраженной специфической активностью и может быть выпущена для лечения поллиноза, вызванного пыльцой ежи сборной, Пример 3. Способ определения специфической антителсвязывающей активности депонированного аллергоида ведут так же, как в примере I, за исключением того, что используют другую серию сорбированного .на Ь-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии.

При этом получают: титр сыворотки, инкубированной с контрольным образцом, 1:1280, титр исходной неинкубированной сыворотки — 1:1280, титр ,сыворотки, инкубированной с опытным образцом, — 1: 1280. Снижение титра не произошло, следовательно, при изготовлении данной серии сорбированного íà L-тирозине аллергоида из пыльцы амброзии имело место нарушение технологического режима, приведшее к инактивации специфических антигенных детерминант аллергоида и препарат утратил специфическую активность, Данная серия препарата не может быть выпущена для использования с целью специфической гипосенсибилизирующей терапии амброзийного поллиноза.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет определить специфическую антителснязывающую активность депонированного аллергоида одновременно по отношению к антителам, принадлежащим к иммуноглобулинам не менее чем двух, классов (Ig М, IgL), что позволяет значительно повысить точность способа определения специфической активности депонированного аллергоида и сократить время исследования до 1 сут.

Формулаизобретения

Способ определения специфической антителсвязывающей активности аллергоида путем добавления специфической сыворотки к аллергоиду и последующей оценки реакции, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет одновременного выявления степени связывания IgG и IgM,èñïoëüýóþò диализованный формальдегидобработанный аллерген-аллергон,сорбированный на

Ь-тирозине, добавляют специфическую сыворотку с титром 1:320 — 10240, при соотношении с депонированным аллергоидом 0,5-0,7:1, оценку осуществляют в реакции непрямой гемагглютинации и при снижении титра сыворотки в 4-512 раз определяют наличие специфической антителсвязывающей активности,