Способ получения пептидов

Способ получения пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ИЗОБРЕТЕНИЕ КАСАЕТСЯ ПЕПТИДОВ, В ЧАСТНОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ ОБЩЕЙ Ф-ЛЫ HR<SB POS="POST">1</SB>-ALA-ASP-ALA-JLE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-GLN-ASP-JLE-R<SB POS="POST">27</SB>-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-NH<SB POS="POST">2</SB>, ГДЕ R<SB POS="POST">1</SB>=TYR ИЛИ HIS+ R<SB POS="POST">27</SB> - NLE, MET, ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ КАК РОСТИМУЛИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА. ЦЕЛЬ - СОЗДАНИЕ НОВЫХ БОЛЕЕ АКТИВНЫХ И МАЛОТОКСИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ УКАЗАННОГО КЛАССА. СИНТЕЗ ПЕПТИДА ВЕДУТ СВЯЗЫВАНИЕМ C-КОНЕЧНОЙ АМИНОКИСЛОТЫ - ГЛИЦИНА С ЗАЩИЩЕННОЙ NH<SB POS="POST">2</SB>-ГРУППОЙ С ПОЛИМЕРОМ-НОСИТЕЛЕМ - СМОЛОЙ МВНА В СООТНОШЕНИИ 2 ММОЛЬ АМИНОКИСЛОТЫ НА 1Г СМОЛЫ В СРЕДЕ МЕТИЛЕНХЛОРИДА ИЛИ ДИМЕТИЛФОРМАМИДА, ИЛИ ИХ СМЕСИ. ЗАТЕМ ПРОВОДЯТ ПОСТЕПЕННОЕ НАРАЩИВАНИЕ ПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ В СООТВЕТСТВИИ С ЦЕЛЕВЫМ ПЕПТИДОМ ДО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕПТИДИЛПОЛИМЕРА Ф-ЛЫ X-R<SB POS="POST">1</SB>(X<SB POS="POST">1</SB> ИЛИ X<SB POS="POST">4</SB>)-ALA-JLE-PHE-THR(X<SB POS="POST">3</SB>)-ASN(X<SB POS="POST">5</SB>)-SER(X<SB POS="POST">3</SB>)-TYR(X<SB POS="POST">4</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">1</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">1</SB>)-VAL-LEU-GLY-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-LEU-SER(X<SB POS="POST">3</SB>)-ALA-ARG(X<SB POS="POST">1</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">6</SB>)-LEU-LEU-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-ASP(X<SB POS="POST">2</SB>)-JLE-R<SB POS="POST">27</SB>-SER(X<SB POS="POST">3</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">1</SB>)-GLN(X*05)-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-GLY-X<SB POS="POST">7</SB>, ГДЕ R<SB POS="POST">1</SB> И R<SB POS="POST">27</SB> УКАЗАНЫ ВЫШЕ

X-ВОС

X<SB POS="POST">1</SB>-ТОЗИЛ

X<SB POS="POST">2</SB>-OBZL

X<SB POS="POST">3</SB>-БЕНЗИЛ

X<SB POS="POST">4</SB>-ДИХЛОРБЕНЗИЛ

X÷КСАНТИЛ

X<SB POS="POST">6</SB>-2-ХЛОРБЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ

X<SB POS="POST">7</SB>-СМОЛА-НОСИТЕЛЬ МВНА. ДАЛЕЕ ПРОВОДЯТ ДЕБЛОКИРОВАНИЕ ПЕПТИДИЛ ПОЛИМЕРА И ОТЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДА С ПОМОЩЬЮ HF СОВМЕСТНО С АКЦЕПТОРОМ-АНИЗОЛОМ ИЛИ МЕТИЛЭТИЛСУЛЬФИДОМ, ИЛИ ИХ СМЕСЬЮ, ПРИ 0-(-20)°С С ПОСЛЕДУЮЩИМ РАСТВОРЕНИЕМ В УКСУСНОЙ КИСЛОТЕ И ОЧИСТКОЙ. 1 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТ У

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯЫ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4027688/23-04 (62) 3692330/23-04 (22) 23.06.86 (23) 12.01.84 (31) 457862 (32) 13. 01.83 (33) US (46) 30.06.90, Бюл. ¹ 24 (71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиз(ПБ ) (72) Жан Эдуард, Фредерик Ривьер (СН), Вили Балкер Вэйл (младший)(US) и Иохим Шписс (ЛЕ) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Химия полимеров./Под ред.

Катсояниса П. М.: Мир, 1977, с. 368. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения соединений общей A-лы

HR;Ala-Asp-Ala-П е-Phe-Thr-Asn-Ser-

Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-S erAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I le-R,—

Ser-Arg-Сlп-Gln-Gly-МН где R „— Tyr или His; R ., — Nle, Net, для использования в медицине как ростостимулирующих средств. Цель — создание новых более активных и малотоксичных веществ

Изобретение относится к способу получения пептидов — аналогов hp GRF человека, новых биологически активных соединений, которые могут найти приме- . нение в медицине.

Цель изобретения — способ получения новых пептидов-аналогов hp GRF человека, малотоксичных, обладающих более высокой ростостимулирующей активностью...SU„„1575944 А 3 (ц) С 07 К 7/10//А 61 К 37/02

2 указанного класса. Синтез пептида ведут связыванием С-конечной аминокислоты — глицина с защищенной ИН. -группой с полимером-носителем — смолой ИВНА в соотношении 2 ммоль аминокислоты на

1 r смолы в среде метиленхлорида или диметилформамида, или их смеси. Затем проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера ф-лы Х-R„(X, или Х )-А1а-Азр(Х,)-Аlа-Ile-Phe-Thr (X g -Asn (X +) -Ser (X )-Tyr (X <) -Arg (X,) -Lys (X,) -Val-Leu-Gly-Gln (Х ) -Leu-Ser (Х з) -Ala-Arg (Х „) -Lys (Х <) -Leu-Leu-Gln (X ) -Asp (Х ) -Ile-R 7-Ser (X>) -Arg (X „) -С1п(Х ) -Gln(X ) -Gly а (Х7), где R) и R „указаны выше, Х-Boc- X,-тозил; Х -OBzl Х -бензил;

Х -дихлорбензил; Х -ксантил; Х -2-, клорбенеилоксикарбонил, Х -смола-носи- С тель 1ВНА. Далее проводят деблокирование пептидилполимера и отщепление пептида с помощью HF совместно с акцептором-анизолом или метилэтилсульфи0 дом, или их смесью, при 0-(-20) С с последующим растворением в уксусной кислоте и очисткой. 1 табл.

Сокращения, используемые в описании:

3)CC-N,N — дициклогексилкарбодиимид;

НО — 1-гидроксибензтриазол;

0Np — и-нитрофенил;

Вос — третбутилоксикарбонил;

Tos — 4-толуолсульфонил;

2С1-z — 2-хлорбензилоксикарбонил;

ЛС — 2,б-дихлорбензил;

0Bz1 — сложный бензиловый эфир, 1575944

60% трифторуксус35 ная кислота/2% этандитиол 10 .,60% трифторуксусная кислота/2% этандитиол 15

IPA/1% этаццитиол О, 5

{10%) в СН Cl 0 5

Me OH 0 5

ЕЕзИ (10%) в СН С1 0,5

МеОН (дважды) 0,5

СН С1 (дважды) 0,5

Связывание предпочтительнее осуществлять по программе В.

Программа В

Реагент Время смешива50 ния, мин

DCC (N,N -дициклогексилкарбодиимид)

Вос-аминокислота

МеОН (дважды)

СН С1 (дважды)

Ас О {ЗМ) в СН Сl

СН С1

50-90

0,,5

0„5

15,,0

0„5

ll p v M е р 1. Синтез )Nle 7hp

СНР/1-32/-NH, имеющего формулу !

Н-Tyr-Ala-Asp-Ala-Tl e-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arp,-Lys-Val-Leu-Gly-G1.n-LeuSer-А1а-Arя,-Lys-.l,eu Leu-Gln Asp-ПеNle-Ser Are-G1n-Gln-Gly-NH>, осушествляют ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман-990", на cMoge хлоргидрата МВНА, такой, например как 10 смола, поставляемая фирмач Bachem, Thc, имеющая диапазон замещения от

О, 1 до 0,5 ммоль/г смолы. Связывание

Вос-Gly к смоле осуществляют способом, описанным в программах А и В, которь и 15 используют в ходе всего синтеза, что приводит к замещению примерно

0,35 ммоль глицина на грамм смолы, Все используемые растворители тщательно обезгаживают путем продувки инерт- 20 ным газом, например гелием или азотом, чтобы гарантировать отсутствие кислорода, который может окислить серу ос татка метионина, что нежелательно.

После удаления защиты и нейтрали- 25 зации пептидную цепь ступенчато нара щивают на смоле. Удаление защиты, нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют IIO сформулированным ниже программам. 30

Удаление защиты предпочтительнее осуществлять по программе А.

Программа А

Реагент Время смешивания, мин

МеОН 0,5

СН С1 < (дважды) 0,5

Таким образом, от 1 до 2 ммоль

Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене используют на грамм смолы в сочетании с одним эквивалентом

1,0 M DCCl в хлористом метилене в течение 2 ч. Когда Вос-Arp (TOS) связан, используют смесь 50% диметилформамида и хлористого метилена. Бензиловый эфир используют в качестве защитной гидроксильной группы боковой цепи для серина и треонина. Пара-нитрофениловый сложный эфир (ONp) используют для активации карбоксильного конца аснатина или глицина. Например, Вос-Asn.(ONp) связывают в течение ночи, используя один эквивалент HOBt в 50% смеси диметилформамида и хлористого метилена, причем в этом случае

DCC не добавляют. Аминогруппу аснатина и глутамина защищают ксантилом, если DCC-связывание примеряют вместо использования активного эфира. 2-хлорбензилоксикарбонил (2С -Z) используют в качестве защитной группы для боковой цепи лизина. Для защиты гуанидиногруппы аргинина используют тозил, а карбоксильную группу глицина или аспарагина защищают сложным бензиловым эфиром (OBzl) . Фенольную гидроксильную группу тирозина защищают с помощью 2,б-дихлорбензила (DCB) . В. конце синтеза получают следующую композицию:

Х-Tyr (Х „) -Ala-Asp (Х ) -Ala-Ile-Phe-Thr(X ) Asn(X )-Ser(X ) -Туг(Х )—

-Arp(X <)-Lys(Х,)-Vyl-T-eu-Gly-Г1п(Х )—

-Leu-Бег(Хз)-Ala ArI,(Х „)-Lys(Х ) — ..., -Leu-Leu-Gln (X <) -Àsð (Õ ) -Пе-Nle-Ser(X >) Arg (X, ) -Gln(X +) -Gln (X+)-Gly-X>, где Х представляет собой Вос, Х „- 703Ell Х - CJIOEHBN 6eH3HJIOBbIH эфир (OBzl), Х > — бензил, Х вЂ” дихлорбензил, Х вЂ” ксантил, Х z — 2-хлорбензилоксикарбонил и Х 7 — -NH-подложка смолы. Ксантил может быть частично или полностью удален при обработке трифторуксусной кислотой, используемой для удаления d-аминозащитной группы.

После связывания остатка тирозина со смолой Вос удаляют с помощью 60%-ной трифторуксусной кислоты в СНдС1 . Для расщепления и удаления защиты с оставшегося защищенного пептида-смолы его обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и

15 мл фтористого водорода (HF) на

1575944 грамм пептида-смолы при -20 С в течео ние 1 — 0,5 ч и при О С в течение

1 — 0,5 ч. После удаления НР под высоким вакуумом остаток смолы-пептида промывают поочередно безводным диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют обезгаженным 2 н. раствором уксусной кислоты и выделяют из смеси фильтрованием.

Отщепленный и лишенный защиты пептид растворяют в 0,5%-ной уксусной кислоте и подвергают очистке, которая может включать тонкую гель-фильтрацию на "Сефадексе DG — 50".

Затем пептид подвергают дальнейшей очистке с помощью препаративной или полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гильзы для Le-500 фирмы Maters associates 20 заполняют С кремнеземом 15-20 мк, поставляемым фирмой Vydac (ЗООА) .

Градиент ацетонитрила создают с помощью аппарата для получения градиента низкого давления фирмы Eldex. Хро- 25 матографические фракции тщательно контролируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и объединяют только фракции, проявляющие существенную частоту. Обессоливание 30 очищенных фракций, проверенных на чис.тоту независимо, осуществляют, используя ацетонитрил в 0,1 -ной трифторуксусной кислоте. Окончательное элюирование осуществляют из аналитической колонки Vydal С, (5 мк), используя смесь буферов А и В. Буфер А представляет собой 0,1 -ную водную трифторуксусную кислоту; буфер В содержит

60 об. ацетонитрила, О, 1% трифторуксусной кислоты, остальное — НгО.

Для изократической смеси, содержащей

58 об. буфера В, пептид элюируют при

9,2 мл. Центральный срез лиофилизируют, чтобы получить нужный пептид, чистота которого составляет свыше

98%.

Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину С 3 и =-57,8 +1 (C-1,1 -ная уксусная кислота, нескорректировано).

Пример 2. Синтез hp GRF аналога (О-Tyr Php GRF(1 32)-ИН, имеющего формулу Н-D-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tvr-Arp-Lvs-Val-LeuЛ 55

-Gly-Gln-Leu-Se r-Ala-Ar g-Ly s-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-1Iet-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH, проводят ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман-990", на смоле 1БНА по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элюировании из колонки при 8,6 мл с использованием 60 об. . буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину (=-6 1, 4 +1 (С= 1, 1%-ная уксусная кислота, нескорректировано) .

Пример 3. Синтез CD-Ме 3— hp GRF(1 32)-NH, имеющего формулу

Н-Tyr-Аlа-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser.-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser — Л1а-Arg-Lys-Leu — Leu — Gln-Asp-Пе-П-Мег-Ser — Arg-Gln-Gln — Gly-NH<, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман-990", на смоле HBHA по способу, описанному в примере 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии при элюировании из колонки при 7,6 мл с использованием

577 буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом полярно+ метре, как величину о =-54,5 +

"1 (С=1, 1%-ная уксусная кислота, нескорректировано) .

Пример 4. Синтез $Gys" j-hp

GRT (1 — 32)-NHg имеющего формулу Н-His— Ala — Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Аг,,— 1.у s— - Va1-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala— Ar g — 1.у s-Le u-L eu-G 1 n-As p-П е-Ме г — Se r-Arg-С1п-Gln-Gly-NH, осуществляют ступенчато, используя пептидный синезатор "Бекман-990", на смоле МВНА по способу, описанному в примере 1.

Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии, при элюировании из колонки при 9,0 мл с использованием 54 буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом поляриметре, как величину

Гс< 3 > =-58,7 +1 (C=1, 1%-ная уксусная кислота, нескорректировано).

Синтез повторяют, используя His в качестве последнего остатка, чтобы получить (His )-hp GRF(1 32)-NH< Определяют чистоту пептида при элюировании из колонки при 9,2 мп с использованием 58% буфера В. Оптическое вращение измеряют на фотоэлектрическом 1 поляриметре, как величину (a(J > =

= — 58,2+1 (С=1,1 -ная уксусная кислота, нескорректировано) .

1575944

Пример 5. Синтез $Gvs" Nle<>j-hp GRF(1 32)-NHg, имеющего формулу

Н-His-Ala-Asp-Ala-ne-Phe-, Thr -Азп-Ser-Tyr-Агя-I.ys-Val-Leu-G1у-Gln-Leu-Ser-Аlа Arg-Lys-Lev.-Leu-Gln-Asp-ПеNle-Ser-Arg-Gln-G1n-G1y-NH<, осуществляют ступенчато, используя пептидный синтезатор "Бекман-990", на смоле

МВНА по способу, описанному в приме- 10 ре 1. Определяют чистоту пептида с помощью тонкослойной хроматографии и высОкоэффективной жидкостной хроматографйи, при элюировании из колонки при

9,6 мл с использованием 57Х буфера В ° 15

Оптическое вращение измеряют на фотоэЛектрическом поляриметре, как величину Pe(3 >д=-59,3 41 (С=1, 1Х-ная уксусная кислота, нескорректировано).

Синтетические пептиды, полученные 20 в различных примерах, сравнивают с очищенным синтетическим hp GRF(1-40)—

-ОН либо с очищенным синтетическим

hp GRF(1-40)-Фен-Гли-NH в анализах

n vitro, .чтобы определить их эффективность как стимуляторов выделения гормона роста. Все эти синтетические аналоги обладают существенной действенностью в стимулировании выделения гОрмона роста. 30

Анализы in vitro выполняют с использованием синтетического hp GRF н качестве- стандарта при параллельном сравнении с эквимолярными концентрациями различных синтезированных аналогов. Используют культуры, содержащие клетки питуитарных желез крысы, удаленные за четыре-пять дней до этого. Культуры, которые считаются опти- 40 мальными для выделения гормона роста, используют для сравнительного испытания по общему способу. Инкубирование с испытуемым веществом осуществляют н течение 3 — 4 ч. Аликвоты культуральной среды удаляют и обрабатывают для измерения содержания н них иммунореакционного гормона роста (ir GH) известным способом радиоиммуноанализа.

Результаты сравнительного испытания с использованием эквимолярных концентраций приведены в таблице.

Испытание in vitro синтетических пептидов показывает, что эффективная концентрация ЕС изменяется от 20

5о до 100 пМ. Самая низкая эффектинная концентрация составляет 3-8 пМ. Максимальная эффектинная концентрация дпя Ьр ГКЕ(1-40)-ИН состанляпа 1 нМ.

Кроме испытаний in vitro проведены эксперименты 1п vivo путем введения синтетического пептида через постоянный катетер свободно передвигающимся самцам нормальных мышей. Животных предварительно обрабатывают FLA-б3 допамингидроксилазным ингибитором, который подавляет спонтанное выделение. гормона роста, .не влияя на реакцию к экзогенному гормональному выделительноглу фактору (GRF) . Образцы крови берут через тот же самый катетер перед введением, ".åðåç 5 и 20 мин после инъекции. Содержание гормона роста в крови измеряют путем радиоиммуноанализа.

Результаты показывают, что синтетические аналоги являются сильными стимуляторами нг>деления питуитарного гормона роста.

В испытаниях in vitro соединение

PD-Tyr ghp GRF. 1-32)NH q несколько слабее, чем соответствующий природный гормон. В испытаниях in vivo оно проявляет биологическое действие по высвобождению гормона роста, которое существенно выше действия соответствующего гормона с незамещенным 32 остатком, а также выше стандарта.

Проведенные испытания показали, что соединения по изобретению малотоксичны и проявляют высокую ростостимулирующую активность.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы

HR „-Аlа-Asp Ala-Ile-Phe-Thr Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-I.eu-Leu-С1п-Asp-Ile-H,-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH, где R „— Tyr D-Tyr или His;

R „- N1e, 1et отличающийся тем, что

С-конечную аминокислоту — глицин с защищенной аминогруппой связывают с по лимером-носителем — смолой МВНА н соотношении 2 ммоль аминокислоты на 1 г смолы, н метиленхлориде, или циметилформамиде, или н их смеси и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера общей формулы

Х-R „(Х „ или Х1) -Ala-Asр(Х,) -Al a-Ile-Phe-Thr(Х ) -Asn(X ) -Ser(Х ) -Tyr

3 з (X <) -Arg (Х,) -T.ys (Х p -Va I.eu-Gly1575944

Биологическая активность описываемых пептидов

Пептид

Относительная действенность in vitro р GRF(1 32)-НН . (His T)-Ьр ГКР(1-32) -NHz (П-Tyr >)-Ьр GRA(1-32) -ЯН (His <, Nle ч $-hp GRF (1-32) -ИН <

3,21(2,02-5,4 )

2, 15 (1, 12-4,41)

О, 74 (0,47-1, 14)

3, 22 (2, 12-5, 33) П р и м е ч а н и е: Относительно hp GRF(1-40)-Phe-G1n-ИН .

Составитель В.Волкова

Редактор А.Маковская Техред М.Дрык Корректор Л.Патай

Заказ 1793 Тираж 318 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

-Gln(X ) -Leu-Бег(Х ) -Ala-Arg(Х <)—

-Lys (Хс ) -Leu-Leu-Gln (Х ) -Аэр (Х ) -Пе-R z7-Ser (X> ) -ArI: (Х,) -Gln (Х ) -Gin (X+)—

-Gly (X у» где R < и К имеют укаэанные значения

Х вЂ” Вос;

Х вЂ”. TosHJI

Х . — ОВэ1;

Хэ —. бенэил; !О

Х вЂ” дихлорбензил;

Х вЂ” ксантил;

Х вЂ” 2-хлорбенэилоксикарбонил;

Х вЂ” смола-носитель МВНА, и полученный пептидил-полимер деблокируют и отщенляют пептид с помощью

-HF вместе с акцептором, таким, как аниэол, метилэтилсульфид или их смесь при температуре 0-(-20)о С с последующим растворением в уксусной кислоте и очисткой.