Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов

Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель - повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 40%-ного раствора эфирата BF 3. Затем проводят элюирование продукта концентрированной CH 3C(O)OH, содержащей 0,06 - 0,38 мл 40%-ного раствора BF 3 в диэтиловом эфире на 10 мл CH 3C(O)OH, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повышают точность анализа в 4 - 6 раз, чувствительность в 2 - 3,5 раза при меньшем в 2,3 - 3,4 раза времени определения, чем в известном случае. 10 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН ц9) (и) 1 57 щ) g G 01 N 30/94

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР (21) 4412380/23-04 (22) 1 8.04.88 (46) 07.07.90. Бюл. У 25 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (72) А,Д.Рошаль, В.И.Циновый и В.Д.Орлов (53) 543.54.42.07 (088.8) (56) Вгаззеиг Т., Angenote L. An aminoethanol. diphenylborate — PEG 400 .

mixture: An interesting reagent for

ЫачопоЫ determination. — J. Chromatogr. 1986, v. 351, У 2, р. 251.

Deddio W., Clark К.W. Biochanin

А and formononetin content in red

clover varieties at several maturity

stages. — Can. J. Plant Sci, 1968, ч. 48, В 2, р. 175.

Curnow D.Í,, 0estrogenic activity

of subterranean clover The isolation of genistein from subterranåàn

clover and methods of quantitative

estimation. — Biochem. J. 1954, v. 58, Р 2, р. 283.

Агаев Ф.Н ° и др. Динамика и рас .1 пределение фитоэстрогенов в наземных органах клевера лугового в онтогенезе. — Физиология и биохимия культурных растений, 1984, т. 16, Р 1, с. 46.

Изобретение относится к способу количественного определения 5-гидроксиизофпавонов, который может найти применение в анализе лекарственных и кормовых трав, галеновых препаратов, 2 (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 5-ГИДРОКСИИЗОФЛАВОНОВ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительг ности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 407-ного раствора эфирата ВР

Затем проводят элюирование продукта концентрированной СН С(О)ОН,содержащей 0,06 — 0,38 мл 407-ного раствора ВР. в диэтиловом эфире на 10 мл

СН С (О) ОН, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повы- шают точность анализа в 4-6 раз,чувствительность в 2 — 3,5 раза при меньшем в 2,3 — 3,4 раза времени определения, чем в известном случае. 10 табл.

Цель изобретения — повышение точности и чувствительности определения и его ускорение.

Пример 1. Определение содержания биоханина А в клевере ладино.

1576859

Фиксированное растительное сырье высушивают, измельчают, отбирают на вески 10 г. Экстрагируют растительный материал 40-50 мл 90 -ного этанола на глицериновой или водяной бане, (t = 60-70 С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Экстракт отделяют, а растительный материал снова заливают этанолом. Извлечение повторяют 4-5 раз, полученные экстракты объединяют, отфильтро .вывают и упаринают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке 5-6 порциями (по 50 мл) петролейного эфира до тех пор, пока ор ганическая фаза не станет бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный ,остаток упаривают на роторном вакуум ном исутарителе почти досуха, затем о гидролизуют его при нагревании (100 C) ! ! a течение 3 ч с 5-10 мл 10 -ной серной кислоты.

Агликоны фенольных соединений извлекают из гидролизата 5-6 порция 25 (, ми этилацетата. Этилацетатные экст,ракты объединяют, упаривают досуха, (:растворяют сумму фенольных соедине. ний в 5 мл метанола. Апиквоту 0,05 мл метанольного раствора наносят в ви де полосы на хроматоГрафическую плас,тину "Силуфол", предварительно очи щенную метаНолом и активированную при о

:нагревании в течение 30 мин при 120 С. Справа и слева от полосы фенольных соединений Наносят пятна меток-свидетелей (биоханина А) . Разделение проводят в камЕрах с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлороформ + метанол + *вода(95-5-0,5), 40

По окончании разделения пластинку, сушат на воздухе 5-10 мин, затем опрыскивают 40 -ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, Полоса, содержащая биоханин А, приобретает"в УФ-свете желто-зеленую флуоресценцию, в видимом свете, если изофлавона много, — светло-желтую окраску ° .

Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают, соскребают силикагель с анализируемым веществом с хроматографической пластинки и заливают его

0,1 мм раствора эфирата BF> и 8 мл концентрированной уксусной кислоты.

Смесь периодически встряхивают в те- 55 чение 25 мин, отфильтровывают от адсорбента и флуориметрируют «Я 0, =

Г

254 нм, „ 0„ = 580 нм}.

Параллельно проводят аналогичные процедуры для получения стандартного и фонового растворов. Содержание 5гидроксиизофлавона опредепяют го формуле

У 11хСо Ф )(— Фср

Х = -------- x ---------, g Ф вЂ” Ф1, где Y — объем метанола для растворения суммы фенольных соедине.ний, мм;

М вЂ” молекулярная масса изофлавонов, г/моль;

С . — концентрация стандартного ра0 створа, моль/л;

g — навеска растительного материала, г;

Ф вЂ” флуоресценция исследуемого раствора;

Ф вЂ” флуоресценция стандартного раствора;

Ф вЂ” флуоресценция фонового раствора;

Х вЂ” содержание 5-гидрооксиизофлавона в растительном материале, мг/г.

Содержание биоханина А в клевере ладино составляет, мг/г: по известному способу — в листьях 1,360, в стеблях 1,331; по предлагаемому способу— в листьях 0,310, в стеблях 0,970.

Пример 2. Определение генистеина и софорикозида в сумме фенольных соединений из Софоры японской.

Сравнение точности предлагаемого способа и известного.

1О навесок, содержащих 0,7-0,9 r суммы фенольных соединений, и 10 таких же навесок с добавлением гени-. стеина в количестве 0,5 кг/г и софорикозида 1 мг/г растворяют в 10.мл метанола. 0,1 мл раствора наносят на хроматографическую пластинку вместе с метчиками 5-гидроксиизофлавонов.

Разделение проводят в системе растворителей хлороформ + метанол 75-25,.R генистеина 0,694+0,02., софорикозида

0,32t0,03. По окончании разделения опрыскивают пластинку раствором эфирата ВР, под УФ-светом очерчивают флуоресцирующие зоны и соскребают их с подложки. Элюирование проводят как в примере 1. Флуориметрируют с использованием стандартно"0 и фонового растворов (табл. 1 и 3).Параллельно проводят определение по известному способу с использованием спектрофотометрии (табл, 2 и 4).

1576859

При определении генистеина на хроматографической пластинке в зоне

К = 0,60-0,75 мало мешающих феноль1 ных соединений. Однако, вследствие невозможности полного удаления 5-гидроксиизофлавона, выход его в известном способе на 15,97 ниже, чем в предлагаемом, точность предлагаемого способа в 4,3 раза вышее.

При анализе софорико зида наблюдается большое количество мешающих фенольных соединений, что приводит в случае известного способа к завышению результатов (10,3 ). Точность предлагаемого способа в 6,4 раза выше, чем известного. Низкий выход внутреннего стандарта в известном способе объясняется одновременным влиянием двух факторов — большим количеством примесей и неполным удалением с пластинки анализируемого компонента.

Пример 3. Приготовление стандартного и внутреннего растворов сравнения.

0,1 0,2 мл раствора известной концентрации наносят на пластинку и подвергают хроматографическому разделе-, нию как в примерах I и 2. Элюирование и флуориметрию проводят так же, как для анализируемых растворов . Фоновый раствор приготавливают по указанной методике из чистого силикагеля, удаляемого с пластинки, с площади, примерно равной площади полос анализируемых на хроматограммах 5-гидроксиизофлавонов ..Использование фоновых растворов необходимо на однолучевых флуориметрах. В двулучевых приборах фоновые растворы использовать не нужно: флуоресценция фона учитывается автоматически.

Пример 4. Выбор реактива для идентификации 5 †гидроксиизофлавонов на хроматографических пластинках

"Силуфол".

Дня определения предела обнаружения проявляю цих реактивов растворы генистеина, наиболее часто встречающегося представителя 5-гидроксиизофлавонов, наносят на хроматографические пластинки в виде полос, содержащих 195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5, 3 мкг.

Результаты определений представле; ны в табл. 5.

Из табл ° 5 видно, что эфират BF является наиболее чувствительным реактивом для идентификации 5-оксииэо20

55 фланонов, в частности его открынаеfl мый минимум" в 4 раза ниже, чем у резактива, используемого в известном способе. В случае идентификации гликозидов, например софорикозида, наблюдается дополнительное увеличение флуоресценции, вероятно, за счет реакции между эфиратом BF> и гликозидной частью молекул определяемых веществ.

Пример 5. Использование эфирата БР для количественного анализа

5-гидроксиизофлавонов.

5.1. Зависимость интенсивности флуоресценции от количества добавленного 407.-ного раствора эфирата три.фторида бора в диэтиловом эфире.

0,2 мп раствора генистеина (1 г/л) в метаноле приливают к 8 мл концентрированной уксусной кислоты (концентрация генистеина в полученной пробе

24,4 мкг/мл) . Затем к полученным таким образом пробам, добавляют различные объемы раствора эфирата ВР . Такие же количества реагента приливают к 8 мл уксусной кислоты, несодержащей изофлавона. Этот раствор используют в качестве фонового.- На основе проведенных исследований установлено, что оптимальное количество эфирата

BF> 0,05 — 0,3 мл на 8 мл уксусной кислоты (0,0б — 0,38 мл на 10 мл кислоты).

Данные приведены в табл . 6.

5.2. Устойчивость флуоресцирующего комплекса во временй.

Готовят флуоресцирующий раствор, состоящий иэ 8 мл концентрированной уксусной кислоты, 0,1 мл раствора эфирата BF и 0,2 мп раствора генистеина в уксусной кислоте, несодержа— щий эфирата BF . Стрелку флуориметра устанавливают на значение I00X и измеряют зависимость флуоресценции от времени.

Из табл . 7 следует, что в течение

30 — 35 мин флуоресценция раствора не изменяется. За это время в процессе анализа 5-гидроксиизофлавоны элюируют с адсорбента, фильтруют элюат и измеряют его флуоресценпию.

5.3. Зависимость интенсивности фпуоресценции от концентрации генистеина.

В раствор, содержащий 8 мп уксусной кислоты и 0,1 мл эфирата ВР, добавляют 0,2; 0,1; 0,05; 0,02; 0,005 мп раствора генистеина в метаноле

1576859 шийся тем, что, с целью повыше-.. ния точности и чувствительности определения и его ускорения, проявление проводят 40Х-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, в качестве элюента используют концентрированную уксусную кислоту, содержащую 0,06-0,38 мп 40Х-ного раствора эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире на 10 мл кислоты, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. пользованием экстракции в 2,3-3,4 ра— за) меньше, чем в известном.

Формула изобретения.

Способ количественного определения

5-гидроксиизофлавонов, включающий экстракцию и очистку фенольных соединений, их хроматографическое разделе - 1О ние на закрепленном слое силикагеля, проявление 5-гидроксиизофлавонов, элюирование их.из силикагеля органическим растворителем, о .т л и ч а юI

Таблица I

> !

Ф -Фе — - — тФе Фу д (>

Фх-Фе

Фс Фу

Внутренний станВыход внутреннего х, х< дарт> мг/г стандарта> Х

0,778 0>225

0,830 0,238

0,844 0,248

0,840 0,244

0,872 0,254

0 855 0 247

0,84! 0,254

0,852 0 262

0,831 0,241

О, 859 0>256

0,5

П р и м е ч а н и е. Дисперсия 0,069, коэффициент вариации 4,40Х.

Таблица 2

Внутренний стандарт,мг/г х, Выход внутренх, А< него стандарта, Х

4,24 ф 0,80 0,5

П р н м е ч а н и е. Дисперсия 0,758> коэффициент вариации 18,0Х.

0,756

0,934

0,773

0,906

0,821

0,917

0,764

0,847

0,853

0,853

О, 934.

0,917

0,773

0,82!

° 0,906

0,764

0,847

0>853

0,756

0>853

О, 1 99

О, 245

О, 242

О, 237

0,220

0,220

О, !99 О, 232

О, 225

О, 232

О, 364

0,313

О, 214

О, 255

0,303

О, 275

О, 198

О> 195

О, 105

О, 220

4,94

4,94

5,90

4,91

5,04 5,04 3 0,15

4,5!

4,89

5,16

4,97

5 13

4,64

4,67

3>30

3,70

3,98

4,29

2,78

2,72

1,65

2,79

0>830

0,844

0,840

0,872

0,855

0,841

0,852

0,831

О, 859.

0> 778

0,296

0,270

О, 281

0,272

0,281

0>252

0,280

0,271

0,212

0,215

5,45

5,40

5,53

5,46

5,47 5,53+0,09 98

5,42

5,67

5,79

5>45

5,62.

5,31

4,76

4,98

4,64

4,89 4,66 1 0,33 84

4,46

4,89

4,86

3,67

4,11

1576859

Таблица3!

Е фс фу

ll a Ф1>-Ф Р фс фт хэ хь

Внутрен2 ни!! стандарт, мг/г

Вмкод внутреннего стандар-. та, 2

0,934 3, 750

О, 764 3,017

0,906 3,600

0,773 3,016

0,847 3,450

0,756 3,!00

0 853 3,550

0,917 3,767

0,821 3,300

0,853 3,483

О, 830

0,844

0,840

0,874

78,72+1,10 1,0 0,855

0>778

0,841

0>852

0,831

0,859

Il р и м е ч а и и е. Дисперсия 2,058, коэффициент вариации 1,8Х.

Та блица 4 хе х, к х

В61код внутреннего стандарта> 7.

Внутренний

А„ стандарт, мг/г

78,43

97, 22

94, 29

89, 39

72,58 86,8616> 43

83,57

87,51

81,56

102,32

81,74

1,0

87 261 5 69 40

П р и м е ч а н н е. Дисперсия 74,21, коэффициент вариации 11,5Х. Оптическую плотность определяют раэбавлением фотометрируемого раствора в

l0 раэ. Таблица 5

Способ идентификации Условия наблюдения и наблю даемый признак

ОткрываеMblH MHHH

Стандартный о ткр ыв а емый минимум, мкг/cM

M3>ì В по лосе,мкг

Визуальная идентификация . Го же

В УФ-свете (253 нм) темная не флуоресцирующая полоса

В УФ-свете (253 нм) в присутствии фенольных соединений клевера ладино

В видимом свете светло- ко— ричневая окраска

0,9

20-40

1,8-3>6

Самопроявление под действием УФ-света в теиение 1 ч

Опрыскивание 0,1%ным FHC 1 5 H .1 !,>1 но!!>

Б видимом свете светло-коричневая окраска

0,917

0,773

0,934

0,821

0,906

0,764

0,847

0,853

0,756

0,853

4,90

5,12

6,00

5,00

4,48

4,35

5>05

4,74

5,27

4,78

78, 36

77>06

77,55

76,17

78,49

80,03

81>22

80,17

78,45

79, 69

0,830

0,844

0,840

0,872

0,855

0,778

0,841

0,852

0,831

0,859

3,400

3,500

3,383

3,567

3,533

3,183

3,450

3,400

3,350

3,533

4,12

5>29

5,35

4,48

4,99

4,31

5,68

5,41

4,8!

4,98

79,94

80,93

78, 61

79,83

80,66 79,69+0>92 97

79,85

80,06

77,88

78,68

80,28

73>40

92,68

94,17

88,86

86,30

80,87

99,86

93,89

85,59

86,63

1576859

I,ðoäoëæåHèå табл. 5

Опрыскивание 0,17.— ным ZrOC1 в метаноле

В УФ-свете желто-зеленая флуоре сценция

40-50

3,6-4,5

4,5

Опрыскивание 0,17ным ZrOC1 в метаноле

В видимом свете светло-желтая окраска

В УФ-свете (253 нм) желтая флуоресценция

4,5-9,0

50-100

Опрыскивание 0,57.-ным

А1С1 в метаноле .

1,8

В видимом свете красно-коричневая окраска

Опрыскивание раствором диазосульфаниловой кислоты в 15%ном Na

В видимом свете желтая ок1,8

Опрыскивание смесью хлорсульфоновая кислота + хлороформ 4+1 раска

1,8-3,6

20-40

0,01 И йода в 0,025 M растворе К3 в воде

В видимом свете коричневая или желтовато-коричневая окраска

Опрыскивание 17-ным В УФ вЂ све (360 нм) желтая дифенилборным эфиром флуоресценция аминоэтанола и 57.-ным

0,9-1,8

10-20 полиэтиленгликолем

400 в метаноле

1,8-3,6

20-40

В видимом свете светло-желтая окраска

0,3-0 5

В УФ-свете (253 нм) яркая . 3-5 желто-зеленая флуоресценция

Таблица 6

Количество, мл, раствора эфирара BF на 8 мл уксусной кислоты

То же, на 10 мл уксусной кислоты

Интенсивность флуоресцен †. ции: в абс. единицах в 7.

Т а блица 7

30 35 40 45

1 5 10 15 20

Время, мин

Интенсивность флуоресценции, %

100,0 100,0 100,0 100,0 100 O 100,0 97,8 94,4 93,3

Опрыскивание 40%-ным раствором зфирата

ВЕэ в диэтиловом эфире

То же

0,00 0,03 0,05 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00

0,00 0.,04 0,06 0 25 0,38 0 50 0,63 1,25

3 15 35 35 35 34 34 29

8,6 42,8 100,0 100 0 100,0 97,1 97,1 82,4

1576859

Таблица 8

0103755738291100

0,0 10,0 13,0 20,0 28,0 35,0 35,5

0,0 28,5 37,) 57,1 80,,0 100,0 100,0

Таблица 9

25,7

44,4

Таблица 10!!родолжительность, мин, по способу

Условия проведения операции

Операция известному предлагаемому

Экстракция н очистка экс- Экстракция на водяной трактов, бане, с 70 с

270-450

450

Разбавление сумею фенольнюх соединенЫ1

Хроматографнческое разделение

30

10

Сушка и проявление

Элюирование

720

Фильтр — синяя илн желтая лента 10

Фильтрование

Фотометрирование

Собственно анализ

785

Анализ + экстракция и очистка фенольных соединений 1230

355-535

При определении гликоэидов стадия тидролиэа отсутствует.

Составитель С.Хованская

Редактор И.Горная Техред М.яндык Корректор О. Кравцова

Заказ 1845 Тираж 498. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Соотношение СН СООН:CH OB

Флуоресценция анализируемо"o раствора

Х извлечения вещества

Время элюнрования

Генистеин (агликоя) извлечение, Х

Софорикоэид, (! лнкоэид) извлечение, Й

Удаление адсорбента с хроматографической пластинки и перемешивание с элюентом

10 15 20 25 30

48,5 60,0 82,8 100,0 100,0

61, 1 72 2 83 3 100 О 100 О

Камера для ТСХ, хромато-. графические пластинки

"Силуфолч

В известном способе спект- 5 рофотометр СФ-16, в предлаг гаемом способе флуориметр

ЭФ-ЗМА