Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика

Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований. Цель изобретения - повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов. Питательная среда содержит следующее соотношение компонентов, мас.%: ферментолизат биомассы микроорганизмов 1-1,3

глюкоза 0,1-0,5

фосфат натрия двузамещенный 0,29-0,32

хлористый трифенилтетразолий 0,07-0,14

альгинат натрия 0,15-0,3

дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационного планшета. После этого планшеты лиофилизируют. При дальнейшем использовании в лунки вносят суспензию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяют визуально по изменению темно-вишневого цвета среды. Первая лунка, в которой среда обесцвечивается, соответствует МПК антибиотика. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН

Щ) 5 С 12 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4428713/30-13 (22) 18.05.88 (46) 15.07.90. Бюл. Ф 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (72) Б.M.Áåêáåðãåíoâ, О.Н.Сперанская, С.П.Резван и П.С,Навашин (53) 615.779 ° 9(088.8} (56) ТУ 59.045.62-86:

Brinkmann J, Kin neues Mikrosystem. Mikrobiologie (Labor Praxis in

der. Nedizin) 1981, U, р ° 28-31. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ

ПОДАВЛЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований. Цель изобретения — повышение точности способа,а также увеличение сроков хранения готовых планшетов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований.

Цель изобретения — повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.X: ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,2

Глюкоза 0,3

„„SU 1578197 А 1

Питательная среда содержит следующее соотношение компонентов, мас.X: ферментолизат биомассы микроорганизмов

1-1,3; глюкоза О, 1-0 5 фосфат натрия двузамещенный 0,29-0,32; трифенилтетраэолий хлористый 0,07-0, 14; альгинат натрия 0,15-0,3; дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационного планшета. После этого планшеты лиофилиэируют. При дальнейшем использовании в лунки вноСят суспенэию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяют визуально по изменению темно-вишневого цвета среды. Первая лунка, в которой среда обесцвечивается, соответствует МПК антибиотика. 1 э.п. ф-лы, 2 табл.

Двуэамещенный натрия фосфат 0,3

Хлористый трифенилтетраэолий 0,1

Альгинат натрия 0,2

Дистиллированная вода Остальное

В дистиллированной воде растворяют 1,2 г ферментолизата биомассы микроорганизмов, 0,3 г глюкозы и

0,3 г натрия фосфата двузамещенного, тщательно перемешивают, доводят рН до 8,0-8,2 20X NaOH, затем кипятят в течение 5 мин и фильтруют, через бумажный фильтр. Устанавливают рН среды 7,6 концентрированным раство1578197 ром НС1. Стерилизуют при 121 С в течение 15 мин.

Готовую среду разливают до 30 мл ( в 96 стерильных мерных колб емкостью

100 мл.

Для раститровки одного антибиотика требуется 8 колб — 8 разведений.

Б первой колбе — максимальная концентрация антибиотика (например, для

10 бензилпенициллина она равна 32 мкг/мл).

Колбу встряхивают до полного растворения и равномерного распределения антибиотика в среде. Затем HoJIOBHHó

Содержимого первой колбы переносят

8о вторую колбу с питательной средой — в этой колбе концентрация антибиотика в два раза меньше, чем в первой колбе (для бенэилпенициллина это 16 мкг/мл). Вторую колбу встряхивают и снова, половину ее содержимого переносят в третью колбу, где концентрация препарата в два раза меньше, чем во второй колбе (для бен.зилпенициллина — 8 мкг/мл). Таким образом готовят все восемь разведений одного антибиотика, а затем готовят разведения остальных антибиотиков.

Выбранные концентрации антибиотиков представлены в табл. 1.

После раститровки всех антибиотиков в лунки планшета с круглым дном вносят по 0,1 мл раствора каждого антибиотика в таком порядке, что первая лунка каждого из 12-ти рядов содержит максимальную концентрацию препарата, а далее следуют двукратноубывающие концентрации антибиотиков ° Например, ряд с бензилпенициллином выглядит так: первая лунка 32 мкг/мл, вторая лунка

16 мкг/мл, третья лунка 8 мкг/мп, четвертая лунка 4 мкгlмл, пятая лунка

2 мкг/мл, шестая лунка 1 мкг/мл, седьмая лунка 0,5 мкг/мл, восьмая лунка

0,25 мкг/мл.

Заполненные планшеты помещаются в холодильную камеру, где постепенно понижают температуру до -40 С. Замоо раживание продолжают в течение 12 ч, После этого в холодильной камере устанавливают общее давление менее

100 мм рт.ст. повышают температуру на 10 С и выдерживают планшеты 40—

50 мин, Затем постепенно поввпиают температуру на 30 С, а когда планшеты нагреваются, поднимают температуру до 40 С. Планшеты выдерживают в этих условиях в течение 4 ч. За это

Пример 3. Питательную среду готовят по следующей прописи, мас.Ж:

Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,3 время содержимое лунок полностью высыхает, образуя за счет альгината натрия тонко дисперсный осадок в виде застывшей пены, прочно скрепленный с дном и стенками лунок.

Иэ эталонной культуры Escherichia

coli ATCC 25922 в пробирке с дистиллированной водой стерильно готовят суспензию, соответствующую 5 ЕД по оптическому стандарту мутности, Инокулят в объеме 0,1 мл вносят в каждую лунку приготовленной системы с помощью пипеточного дозатора. Планшеты помещают в термостат и инкубируют при 37 С в течение 18 ч.

Оценку результатов исследования проводят визуально по изменению окраски от темно-вишневого до образования прозрачной среды беэ окрашивания, Концентрация антибиотика в последней лунке с .задержкой роста в ряду разведений антибиотика — прозрачная среда, без темно-вишневого окрашивания., соответствует значению мини" мальной подавляющей концентрации (MIIK) данного антибиотика в отношении использованного эталонного штамма E. coli АТСС 25922. Установлено полное совпадение результатов по уровням ИПК для всех 12 антибиотиков.

Пример 2. Питательную среду готовят в соответствии с примером 1 по следующей прописи, мас.7:

Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,0

Глюкоза 0,1

Двуэамещенный натрия фосфат 0,29

Хлористый трифенилтетразолий 0,07

Альгинат натрия 0,15

Дистиллированная вода Остальное рН после стерилизации 7,2-7,4.

Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведений и способ определения ИПК изученных антибиотиков для штамма E. coli АТСС 25922 аналогичен примеру 1.

Установлено полное совпадение результатов по уровням MIIK для всех изученных антибиотиков.

15781

0,5

1О

0,29-0,32

Таблица 1

32,0-0,25

32,0-0,25

32,0-0,25

512,0-4,0

t28 0-1,0

128,0-1,0

32,0-0,25

32,0-0,25

128,0 — 1,0

64,0-0 5

32,0-0,25

Бензилпенициллин

Оксациллин

Ампициллин

Карбенициллин

Цефалотин

Канамицин

Гентамицин

Амикацин

Полимиксин

Тетрациклин

Эритромицин

1люкоза

Двузамещенный натрия фосфат 0,3?

Хлористый трифенилтетразолий 0,14

Альгинат натрия 0,3

Дистиллированная вода Остальное рН после стерилизации 7,2-7,4.

Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведений и способ определения МПК изученных антибиотиков для штамма Е coli ATCC

25922 аналогичен примеру i °

Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех изученных антибиотиков.

В табл. 2 представлены результаты определения MIIK. 20

В табл. 2 представлены результаты определения МПК некоторых антибиотиков в отношении трех эталонных культур

Staphylococcus aureus ЛТСС 25923, Е. coli ATCC 25922 и Pseudomonas 25

aeruginosa ATCC 27853. Для них известны значения МПК выбранных антибиотиков, которые приведены в табл. 2 (для каждой культуры — правый столбец цифр). В левом столбце приведены результаты определения МПК тех же антибиотиков, полученные с помощью известного способа и с помощью полуавтоматической системы MIC-2000 известный).

Как видно из табл. 2, модифицированный способ определения МПК антибиотиков позволяет значительно более точно определять уровни антибиотикочувствительности.

Использование способа позволяет повысить точность определения, упростить и ускорить его эа счет использования предварительно заготовленных и лиофилизированных планшетов, которые могут храниться без потери актив45 ности антибиотиков в течение 12 мес. при 4 С.

Формула изобретения

1. Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика путем приготовления двукратных серийных разведений антибиотика в питательной среде, содержащей источник азота, 97 6 соль натрия, фосфат и дистиллированную воду, с последующим заполнением лунок титрационного планшета приготовленными разведениями, внесением в них суспензии микроорганизмов, инкубированием посевов и учетов результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, питательная среда дополнительно содержит глюкозу и хлористый трифенилтетразолий, в качестве источника азота — ферментолизат биомассы микроорганизмов, в качестве соли натрия— альгинат натрия, в качестве фосфата двузамещенный фосфат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.7:

Ферментолиэат биомассы микроорганизмов 1,0-1, 3

Глюкоза О, 1-0,5

Двузамещенный фосфат натрия

Хлористый трифенилтетразолий 0,07-0, 14

Лльгинат натрия 0,15-0,3

Дистиллированная вода Остальное и учет результатов проводят по изменению цветности среды. !

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения сроков хранения готовых планшетов, планшеты после заполнения лунок средой с антибиотиком лиофильно высушивают.

Антибиотики Область двукратных разведений в мкг/мл

1578 197

1 }с о о л л

I

1 !

1 О

0 0

° л >,С>

С4 о л (0 о о о л л л (>O (Ч м I м

° «c tn 1

1 i-> cv I

I о

I v u ! и

° }-с ! сс! 4 1

0 л

>О}с

О 0 О л л л

С> л

СЧ

О> л

С>

O 0 л л 3 СЧ

С> 07 О 1

Î0Î О О «00000eeV л «Я л л О. > л л л л л л л

М - СО - СО СО (О М О 0 оо л л чф

1 1 4 с» I

1 Я „-3 I

Н м} I

".1 м 1 сс} с>

О \ с» с 4 1

=1 I

u u и о о1 о о

1 т" ("а 1

1 с.>

1 с>>

}с СЧ о л л л о - о

О > м л

СЧ

О >

« л о о о м л

С>

О л ь

СЧЮ МО1 Л ОСЧСЧ

- О e e Ю О М О М CV — О> л л л л л л л л л л л «л л л л оомоооо оо-ооооо

1

М

1 х

М М о у о

1 1

Э>ХЭ> 1 1

1 Й Й

Э tU с>} 1

Ц с>

Э

Э Ю а с»

И Ж

Ф

Э 5 Э (с> Э }с>

m ас>

И Р Ж

cd

}" х

I м I

cc}

1„" сс}

1

I

I Х

}4 х о х

Э а м о и СО

° лс с>с> м

Н 0

Э <.3

cd 1-> сб

Р ооооо 0 С>

«л л л л о -о с>о ("4 К > 4, ) } л (сД л «л > ) Ц;) л О со с > <ч о со

1„

I з

Х

1 4 х

1 о с

1 & и и

1 сб

1 а

Л

1 Ф