Способ микроклонального размножения гибридов осины

Способ микроклонального размножения гибридов осины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться при воспроизводстве лесных древесных растений. Целью изобретения является повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что в культуру вводят меристемы пазушных почек и культивирование осуществляют в три этапа на модифицированной различными фитогормонными добавками питательной среде Мурасиге-Скуга. 8 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН щ) С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

;(21) 4472702/31-13 (22) 10.08,88 (46) 30.07.90. Бюл. Р 28 (71) Отдел биохю ии и цитохимии Башкирского филиала AH СССР и Институт физиологии растений AH СССР (72) P.Ê.Áàéáóðèíà, З.Х,Хайруллина, Н.В,Катаева, H.Â.Ñòàðîâà и P Ã.Áóòåíêî (53) 578.085.23 (088,8) (56) Ahyja М.R. Somatic сеll differentiation and raped сlопаl propagation of aspen. — Selvae Genetica, 32, 131-135, 1983.

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться при воспроизводстве лесных древесных растений в лесном и сельском хозяйстве, Цель. изобретения — повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения.

Способ состоит в том, что в качестве исходных эксплантатов используют меристемы верхушечных и пазушных почек неразмножающихся черенкованием гибридов осины с тополем, инициацию почек и формирование конгломерата микропобегов проводят на основной питательной среде Иурасиге-Скуга с добавками 15-30 мг/л сульфата аденина, О, 15-0,25 мг/л 6-БАП, 0,05-0,15 мг/л ИУК (среда 1) с последующим разделением, субкультивированйе и,удлинение побегов проводят. на основной среде с добавками 0,05-0,2 мг/л 6-БАП, 0,01„„SU„, 158 I 741 .. А 1

2 (54) СПОСОБ МИКРОКЛОНЛЛЫ!ОГО РЛЗ! !НОЖЕНИЯ ГИБРИДОВ ОСИНЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может применяться при воспроизводстве лесных древесных растений. Целью изобретения является повы— шение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножения, Способ состоит в том, что в культуру вводят меристемы пазушных почек и культивирование осуществляют в три этапа на модифицированной различными фитогормонными добавками питательной среде !!урасиге-Скуга. 8 табл.

0,03 мг/л НУК при отсутствии аденина и инозита (среда 2) с последующим укоренением растений на основной среде с уменьшенной вдвое концентра- м цией минеральных солей, содержащей

0,3-0,6 мг/л ИИК (среда 3). Культуры вырашивают при освещении люминесцентными лампами (5000 лк) на 16 †часов о светопериоде при 25 С и 70,"7 относи- 4 . тельной влажности воздуха. Укорененные

Мва

1 растения — регенеранты. высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт.

Способ осуществляют слелующим образом. Иолодые неодревесневшие побеги, Ф длиной 3-5 см обмывают в слабом мыль- Ъ ном растворе, затем промывают нодопроводной водой. Растительный материал стерилизуют сначала в течение

1 мин в 703-ном спирте и 20 мин в

10Х-ном растворе хлорамина с последу,1 581741 ющей 3-кратной промывкой дистиллированной водой. В стерильных условиях (в ламинаре) отделяют почки от побеГов и выделяют зону меристемы верхушеч, ной или пазушной почки. Исходный эксплантат помещают на праавтоклавированную питательную среду 1 в про- бирки. Среда 1 для роста пассек содержит кроме основной среды Мурасиге- 1р

Скуга 15-30 мг/л сульфата аденина, 0,15-0,25 мг/л 6-БАП и 0,05-0,015 мг/л

ЯУК. На этой среде в течение 4-5 недель происходит набухание, раскрытие

И .рост почек с последующим образова" 15 нием конгломерата коротких побегов с 2-3 небольшими листьями (до 20-50 . побегов). Образовавшийся конгломерат побегов разделяют под микроскопом на отдельные побеги и помещают на 2р среду 2, на которой происходит рост побегов в длину и закладка пазушных почек. Эта среда кроме основной питательной среды содержит 0,05 — .

0,20 мг/л 6-БАП и 0,01-0,03 мг/л НУК 25 при отсутствии аденина и инозита.

На среде 2 наблюдается развитие многочисленных пазушньгх побегов. Так, на каждом первоначальном побеге образуется 2-3 побега в пазухах листьев,.

При перенесении побегов, возникающих из пазушных почек, на свежую среду 2 наблюдается повторение процесса активации роста пазушных почек (т.е. мультипликация), Процесс мультиплика 35 ции можно повторять многократно, достигая таким образом максимального выхода числа побегов из одного эксплантата. Таким образом, процесс дифференциации и роста растений состав- 40 ляет 6-9 недель. Побеги гибридов, достигшие 3-4 см в длину, пересаживают на питательную среду 3 для укоре" нения. Эта среда состоит из минеральных солей по Мурасиге-Скуга, концент- 45 рация которых уменьшена вдвое, никотиновой кислоты О, 1 мг/л, пиридоксина-НС1 О, 1 мг/л, тиамина — НС1

1,0 мг/л и ИМК 0,3-0,6 мг/л, Концентрация сахарозы 27.. На этой среде по- 0 беги формируют корни через 7-10 дней.

По достижении корнями 3-5 см в длину растения пересаживают в почву. РастеНия, укоренившиеся в сосуде., легко переносят пересадку в нестерильную 55 почву и акклиматизацию к внешним условиям. Приживаемость растений составляет 85-907.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Материалом для размножения служат высокогетерозисные гибриды осины с тополем P.tremula хР, а1Ъа, P.alba x P.Bolleana, Верхушечные и пазушные почки берут с деревьев, возраст 26-32 r. из нескольких гибридных комбинаций. "осина 23 х тополь белый 12, осина 29 х тополь белый 95, тополь белый х тополь Балле 8, Ветки с деревьев, взятые в февралемарте, ставят в сосуды с водой для индукции развития верхушечных почек, Молодые неодревесневшие побеги длиной

3-5 см отрезают, обмывают в слабом мыльном растворе, затем промывают водопроводной водой. Растительный материал стерилизуют сначала в течение

1 мин в. 70Х-ном спирте и 20 мин в

107.-ном растворе хлорамина, затем трехкратно отмывают стерилизованной дистиллированной водой. После этого в стерильных условиях (шкаф с ламинарным течениемвоэдуха УОБВ) отделяют почки от побегов, удаляют у них покровные чешуи. Исходный эксплантат состоит из зоны меристемы верхушечной или пазушной почки длиной 2,0-3,0 мм.

Пробирки со средой 1 (табл.1) с добавками БАП 0,2 мг/л и ИУК О, 1 мг/л (оптимальные концентрации) автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, воду— при 1,5 атм в течение 1 ч. Эксплантаты помещают на питательную среду 1 в биологические пробирки (21х200 мл), которые закрывают стерилыыми марлевыми пробками. Пробирки помещают на светоплощадку при освещении люминесцентными лампами (5000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25 С и 707. †н относительной влажности воздуха, В течение 4-5 недель на среде 1 происходит набухание, раскрьггие и рост почек с последующим формированием конгломерата коротких побегов с 2-3 листочками (до 20-50 побегов), Под микроскопам (в ламинаре) разделяют конгломерат коротких побегав. на от- . дельные побеги и помещают на среду 2 (табл,1) с добавками БАП 0,1 мг/л и НУК 0,02 мг/л (оптимальные концентрации), на,которой происходит рост побегов в длину и закладка пазушных почек в течение 2-4 недель, На этом этапе наблюдается развитие многочисленных пазушных побегов. Проводят 2кратную мультипликацию побегов. возФормула

Способ микроклональиого размножения гибридов осины, включающий культивирование меристем пазушных почек

4О на модифицированной среде 11урасигеСкуга, содержащей 11Н 110з, КИО, СаС1 к

< 2Н 20, I1gSO < 711»0, КН, РО,, Na Эт 1А х 2Н20, FeSO< 7Н20, НзВОз, ИпЯО 4Н О, Епяол 7Н20, KI, Ца214ООФ 21 20, СпБ04к

45 х5Н20, СаС1 г бН20, сахарозу, никотиновую кислоту, пиридоксин ПС1, тиамин

НС1 и воду до получения растенийрегенерантов с последующей высадкой их в открытый грунт, о т л и ч а ю—

50 шийся тем, что, с целью повышения выхода размножаемьж растений и ускорения процесса размножения, культивирование осуществляют в три .этапа, при этом. на первом этапе — инициации и формирования конгломерата побегов в питательную среду добавляют инозит, сульфат аденина, б-бензиламинопурин, индолилуксусную кислоту, при следую-. щем соотношении компонентов, мг/л:

5 158 никающих иэ пазушных почек, т.е. на каждом первоначальном побеге образуется 2-3 побега в пазухах листьев.

При перенесении этих побегов, возникающих из пазушных почек, на свежую питательную среду 2 наблюдается повторение процесса активации роста пазушных почек, которые в свою очередь дают новые побеги для новой пересадки. Продолжительность дифференциации и роста побегов занимает 6-9 недель в зависимости от клона. Побеги гибридов, достигшие 3-4 см в длину, пересаживают на питательную среду 3 с добавкой ИИК 0,5 мг/л (оптимальная концентрация) (табл.1) для укоренения.

Процент укоренения составляет 84-90 в зависимости от клона. На этой среде побеги формируют корни через 710 дней. По достижении корнями длины

3-5 см растения пересаживают в почву.

Перенос растений осуществляют следующим образом, Растения со сформировавшимися корнями осторожно вынимают из агара, тщательно отделяют прилипший агар, обмывают в воде и непосредственно переносят в почву с песком (1:1).. Растения обильно поливают, Приживаемость растений составляет

85-90 . Наблюдается нормальный рост и развитие этих растений.

II р и м е р 2. Ветки с деревьев., взятые в феврале-марте, ставят в со.суды с водой для индукции развития верхушечных почек. С молодых зеленых побегов отделяют почки и культивируют их на среде 1 с различными концентрациями гормональных веществ, В табл.2-4 представлены предельные значения и оптимальные концентрации

БАП и ИУК соответственно.

Пример 3. Растительный материал тот же, что и в примере 1 и 2.

После культивирования на среде 1 по- . лученные множественные микропобеги отделяют и субкультивируют индивидуально на среде 2 с различными концентрациями БАП и НУК с целью удлинения. Экспериментально определяют предельные значения и оптимальные концентрации БАП и НУК соответственно.

Результаты представлены в табл.5 и 6.

Пример 4. После культивирова- ния на средах 1 и 2 выросшие микропобеги пересаживают на среду 3 для сти-муляции образования корней с различ1741 6 ными концентрациями 1МК. Экспериментально определяют предельные значения и оптимальные концентрации ИМК.

Результаты приведены в табл.7.

В культуру вводят растения нескольких гибридных комбинаций. Данные по сравнительной эффективности регенерации, роста и укоренения побегов

10 приведены в табл.8 °

Преимуй ествами предполагаемого способа являются: возможность промышленного использования в лесном хозяйстве ценных высокогетерозисных гибри15 дов осины с тополем, которые ранее не могли быть использованы в производстве вследствие невозможности их размножения черенкованием, возможность м ссового получения посадочного материала с сохранением генотипа от элитных деревьев, регулирование скорости микроразмножения в зависимости от производственных условий; возможность многократной мультипликации, высокий процент укореняемостн и выживаемости растений (85-902), сокращение сроков дифференциации и роста растений до

6-9 недель; подготовка укоренившихся растений в условиях теплицы к началу

30 весенней вегетации в открытом грунте, возможность выращивания посадочного материала независимо от времени года. изобретения

1581741

ИН„ИО 1650

KNO3 1900

СаС1 2Н О 440

М8$04 7Н О 370

КНУРОВ 170

Иа ЭДТА 2Н 0 37,3

Ге$о 7Н О 27,8

Н3ВОЗ 6,2

Мп$0, 4Н, О . 22,3

ZnSO. 7Н О 8,6

KI О 83

NaMoO4 ?Н О 0,25

CuSO4, 5Н 0 0,025

° СоС1 " бн о 0,025

Сахароза 30000

Инозит 100

Никотиновая кислота 0,5

Пиридоксин НС1 0,1

Тиамин НС1 0,1

Сульфат аденина 15-30

6-Бензиламинопурин 0,15-0,25

Индолилуксусная кислота. 0,05-0,15

Вода До 1 л на втором этапе †. субкультивирования и удлинения побегов — в питательную среду добавляют 6-бензиламинопурин, нафтилуксусную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мг/л:

ИН .ИОз

КИО, 1900

СаС1 т ° 2Н20 . 440

М8$О,.7Н,О 370

КН РО4 170

Na ЭЛТА 2Н О 37,3

FeSOq 7Н О 27,8

НзВОз

6 2

Мп$04 4Н О 22,3

ZnSO4 7Н О 8,6

KI 0,83

NaI4oO4 2Н О 0,25

Сп$04 5Н О 0,025, СоС1 6Н О 0,025

Сахароза 30000

Никотиновая кислота 0,5.

Пиридоксин НС1 0,.1

Тиамин НС1 0,1

6-Бензиламинопурин 0,05-0,20

Нафтилуксусная кислот а 0,01-0, 03

Вода До1л на третьем этапе — укоренение растений - в питательную среду добавляют

20

Таблица1

Состав основной

Среда среды Мурасиге-Скуга, мг/л 1 2

ИН4ИО,, 1650

KNOэ 1900

СаС1 ° 2Н О 440

MgSO4 7Н О 370

35 КН РО, 1 7О

Na ÝÄÒÀ.2Н 0 37,3

Ре$04 7Н О 27,8

НэВОз 6, 2

Мп$0 4 4Н О 22, 3

ZnSO4 7нто 8 6

К1 0,83

Na

CuSO4 5Н 0 0,025

СоС1 6Н О 0,025

Сахароза 30000

Инозит 100

Никотиновая кислота 0 5

Пиридоксин НС1 0 5

50 Ти,„ин НС1 — О, 1

Глицин 2,0

Сульфат аденина

6-Бенэиламинопурин (6-БАП) + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+

20000

+ + 0,1

0,1 0 1 ..0,1

+ + +

15-30—

0 15 0 05

0,25 0,20

Индолилуксусная кислота (ИУК}

0,050,15 индолилмасляную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мг/л:

ИН ИОэ 825 кио, 950

СаС1 2Н О 220

Ма$04 7Н О 185

КН РО4 85

Иа ЭДТА 2Н О 18,65

Ге$01 7Н 0 13,9

Нэвоз 3,1

MnSO< 4Н О 11, 15

ZnSOq 7Н 0 4,,3

KI О, 415

NaMoO< 2Н О О, 125

CuSO4 5H O 0,0125

СоС1 6Н О О, 0125

Сахароза 20000

Никотиновая кислота О, 1

Пиридоксин НС1 0,1

Тиамин НС1 0,1

Индолилмасляная кислота 0,3-0,6

9 1581741 . Продолжение табл.!

Концентрация ИУК, мг/л

Среда

Эффективность роста почек, Е

1 2 13

0,05

О, 10

О, 15

59

Нафтилуксусная кислота (НУК) г

QiOf

0,03

1О

Таблица5

Индолилмасляная кислота (Ж!К) 0 3з

0,6

Таблица2

0,05

0,10

0,20

3,7

4,2

2,9

Концентрация BAII, Эффективность роста (мг/л) . почек, Ж

Т а б л и ц а 6

64

0,15

0,20

0,25

0,01

0,02 0 03

3,4

4,1

2,7

Таблица3

Таблица7

Концентрация суль- Эффективность. фата аденина, мг/л роста почек, 7

82

0,3

0 5

0,6

35 I

Тзблнцаб

Эффективность роста изолированных почек, Х

Эффек тнвность побегообразовання, Гибриды

Эффективность укоренения, 2

Осина 23 х тополь белый 12 (дерево 1)

Осина 79 х тополь белый 95

Тополь белый х х тополь Вопле -8

91

69

85

68

П р и и е ч а и и е. Эффективность роста изолированных почек — количество почек ° введенных в культуру, выраяенное в 7 от исходного количества, эффективность побегообраэования — количество побегов, выросщих в культуре тканей, выраженной в Х от исходного количества; эффективность укоренения— количество укореннваихся растений, обладающих высокой прививаемостью в почве и хорошим ростом побегов и корней, выращенное в 1 от исходного количества.

Состав основной среды Иурасиге-Скуга, мг/л

Концентрация БАЛ, Средняя длина мг/л побегов, см

Концентрация НУК,1, Средняя длина мг/л побегов, ом

30 Концентрация 11г1Кз;Эффективность кор1 мг/л необразования, Ж