Способ получения альбумина и гемоглобина

Способ получения альбумина и гемоглобина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения получения основных протеинов плацентарной гемолизированной крови. Цель изобретения - повышение производительности процесса. Способ осуществляют следующим образом. 150 кг человеческой плаценты дробят в замороженном виде, диспергируют в 150 л воды и 22 л этанола при T=°С до конечной концентрации 8%, затем эту суспензию перемешивают , фильтруют, к полученной жидкости добавляют соляную кислоту нормальной концентрации для доведения РНдо 5,1 при перемешивании T=0°С. Осветвленную кровь подвергают ультрафильтрации и после концентрации до 60 Л диафильтруют.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК...Яи,;„дщш (5g)g А 61 К 37/02, 37/14 (!

1 г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3764663/30-14 (22) 05.07.84 (31) 8311323 (32) 07.07.83 (33) ГР (46) 30.08.90. Бюл. У 32 (71) Энститю Иерье (FR) (72) Жан-Луи Тайо, Поль Анник Гат. тель и Иишвль Андре Тарди (FR) (53) 615. 361. 018. 51/55 (088. 8) (56) Tayot J.L., Tardy М., Yattel P.

Plasma protein fractionatioi1, Ed.

Curling. New York> London, 1980, р. 149-159. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУИИНА

И ГЕИОГЛОБИНА (57) Изобретение относиття к.иедици-Изобретение относится к медицине и касается способа получения основных протеинов плацентарной гемолизированной крови, а именно альбумина и гемоглобина.

Целью изобретения является повышение производительности процесса.

Пример 1. 1. Этап осветления гемолизированной плацентарной крови.

150 кг целовеческой плаценты дробят в замороженном виде и диспергируют в 150 л воды, к которой добавляют

22 л этанола при температуре 0 С до конечной концентрации 87.. Полученную таким образом суспензию энер-. .гично перемешивают, затем подвергают фильтрации на прессе объемом 400 л, оборудованном металлической сеткой с пористостью 50 мкм, для отделения

2 не и касается способа получения основных протеинов плацентарной гемолпзированной крови. Цель изобретения повышение производительности процесса. Способ осуществляют следующим образом. 150 кг человеческой плаценты дробят в замороженном ниде, диспергируют в 150 л воды и 22 л этанола при

Т=О С до конечной концентрации SX., затем эту суспензию перемешивают, фильтруют, к полученной жидкости добавляют соляную кислоту нормальной концентрации для доведения рН до

5,1 при перемешивании и Т=О С. Осветленную кровь подвергают ультрафильтрации и после концентрации до . 60 л диафильтруют. кровяного сока .от плацентарньгс тканей. Полученная жидкость занимает объем, равный 270 л. К ней добавляют либо уксусную кислоту, либо соляную кислоту нормальной концентрации (выбор кислоты не имеет значения) для доведения рН до .5,1 при перемешивании и температуре 0 С.

О

Через 2 ч суспензию вводят со скоростью 300 л/ч в центрифугу, удаляют осадок в количестве 7-10 кг (в разные дни по разному). Полученная в отстое кровь абсолютно прозрачна и занимает объем приблизительно

260 л.

2. Стадия концентрации и диафильтрации осветленной крови.

Используют ультрафильтр с мембраной, имеющей порог поглощения, рав1590031 ный 10 000 Дал. Для этой операции хорошо подходят, например, два спиральных фильтрующих элемента по 5 м каждый фирмы Миллипор. После концент5 рации до примерно 60 л рН устанавливают равным 5,5 с,помощью нормального раствора едкого натрия,, а затем диафильтруют при постоянном объеме с помощью примерно 200 л умягченной воды..Скорость удаления ультрафильтрата равна примерно 50 л/ч при давлении на входе, равном 4 бар, Вся операция продолжается примерно 8 ч при 4 С. Конечное значение рН близ-. ко к 5,25 и не изменяется. После регенерации ультрафильтр может использоваться без засорения еще 200 раз.

После отстаивания в. течение 15 ч о при 4 С, концентрированная кровь содержит легкий осадок эуглобулинов, который удаляют центрифугированием.

Полученный осадок имеет вес 100—

300 r в зависимости от партии. Концентрированную осветленную кровь в 25 объеме 120 л фильтруют на мембране с пористостью 0,2 ммк и сохраняют в условиях стерильности до следующей стадии.

3. Стадия хроматографического раз- gp деления. Колонну диаметром 16 см и высотой 1 м заполняют 9 кг Spheeodex-EE, уравновешанном в фосфатном буфере, 0,01 И, рН 5,25 в стерильных условиях. Отфильтрованные и концентрированные 120 л крови, которые

35 были получены на предыдущей стадии, вводят в колонну со скоростью 40 л/ч.

Колонку промывают затем 40 л буфера

РО., 0,01 И, рН 5,25. Фильтрат в объеме 135 л, содержащий гемоглобин и иммуноглобулины, полностью лишен альбумина. Он сохраняется при температуре 2 С до следующей стадии.

Зафиксированный на колонке альбумин вместе с другими протеинами затем элюируют посредством введения 60 л раствора NaC1 с концентрацией 20 г/л. . Объема в 50 л достаточно для количественного извлечения альбумина, т.е. примерно 1200 г (в среднем

8 r/êã плаценты). Этот раствор альбумина следует затем подвергнуть известным стадиям очистки, пссле чего

его можно использовать в медицинской

55 практике. После промывки раствором с концентрацией 0,1 N и спиртом, колонка готова к новому циклу использования.

На одной колонке быпо осуществлено более 50 циклов без потери эффективности, 4. Конечное разделение гамма-глобулинов и гемоглобина. устанавливают концентрацию хлорида натрия в предыдущем Фильтрате (135 л),. равную 8 г/л, рН 7,0 и фильтрат охлаждают до О С. Затем постепенно добавляют 45 л охлажденного до -20 С этанола при перемешивании и B конце добавления устанавливают окончательную температуру, равную -5 С. После ночи полученную суспензию центрифугируют со скоростью 300 л/ч. Полученный осадок гамма-глобулинов весит в среднем 900 r (данные по нескольким партиям) и затем его следует подвергнуть другим операциям очистки. которые известны, для получения иммуноглобулинов, пригодных для Нс пользования в медицине.

Надосадочный слой полностью проз-. рачен. Он содержит практически избавленный от иммуноглобулинов гемоглобин. его разводят 300 л воды при температуре 0 0 для того, чтобы снизить

0 концентрацию ниже 10Е. Этот раствор концентрируют посредством ультрафильтрации по описанной системе, он может быть в конце подвергнут диафильтрации для регулирования ионной силы и состава раствора в соответствии с его будущим использованием. Количест-. во полученного таким образом гемоглобина равно 3700 г, т.е. его выход близок к 25 r/êã плаценты.

Пример 2. Пример 2 повторяют аналогично примеру 1, за исключением того, что на стадии 1 осветления концентрация спирта составляет 157.

Пример 3. Осуществляют как и в примере 1, но за исключением то- го, что в конце стадии 2 концентрации и диафильтрации осветленной крови величину рН доводят до 6,8. В конце десятка циклов хроматографии констатируют, что колонка слегка подкрашена, что соответствует небольшому количеству протеина. Однако колонка еще не засорена, что указывает на значительный прогресс по сравнению с известным уровнем техники.

H p и м е р 4. Повторяют условия примера 1, но за исключением того, что в конце стадии концентрации и диафильтрации осветленной крови ве1 6

Что касается способов, в которых не применяется хроматография, например селективного осаждения этанолом или другим растворителем, например сульфатом аммония, каприловой кислоты, риванолом, то они приводят к денатурации гемоглобина, который нельзя испольэовать, в то время как гемоглобин, полученный по предлагаемому способу неденатурирован.

Что касается альбумина, полученного по предлагаемому способу, то он содержит мономеров 1007., содержание агрегатов практически не определимо ° Лльбумин стабилен при нагревании его при температуре 57 С в течео ние 50 ч.

Составитель С.Мельникова

Редактор Ю.Середа. Техред .Л. Сердюкова

Корректор Л.Пилипенко

Заказ 2549 Тираж 553 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,fpf.5

f59003 личину рН доводят до 4,8. Осущест-! вляют стадию хроматографического разделения, которая проходит беспрепятственно, но выход альбумина уменьшен.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что хроматографию осуществляют на колонке с ДЕАЕ=сефарозой. Колонку уравновешивают и промывают тем же буфером.

Фильтрат, содержащий гемоглобин и гамма-глобулины, полностью очищен от альбумина и его рекуперируют путем элюирования за счет раствора NaC1 в концентрации 20 г/л. f5

Пример 6. Осуществляют аналогично примеру 1, заменяя колонку для хроматографического разделения с ДЕАЕ трисакрилом. Полученные результаты те же, что и в примере 1.

Свойства полученных альбумина и гемоглобина, такие же, как и в примере 1.

Преимущество предлагаемого способа перед известным закЛючается в возмож- 25 ности промышленной обработки значительных количеств плацентарной гемолизированной крови путем разделения основных. белков крови на хроматографической колонке с почти непрерывным 30 ее использованием без замены.

Предлагаемым способом можно обрабатывать хроматографией много тонн плацентарной крови в день, не заменяя хроматографической колонки, в то вре мя как для известного колонки необходимо менять в конце десятка прохождений, в то время как в предлагаемом они остаютея без изменения. Во всех других способах при хроматогра- 40 фии гемолизированной крови колонки систематически засоряются.

Формула и э обретения

Способ получения альбумина и гемоглобина из плацентарной крови путем обработки гемолизированной плацентарной крови этанолом, фильтрации и хроматографического разделения на анионообменнике, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения производительности процесса, обработку этанолом проводят в концентрации 8- 157 после фильтрации, фильтрат подкисляют до рН 5,1 и осветленную кровь подвергают ультрафильтрации и диафильтрации, а хроматографическое разделение проводят на сферодексе-SS, или на ДГЛЕ-сефарозе, или ДЕАЕ-трисакриле при рН 4,86,8, а оставшийся гамма-глобулин удаляют из гемоглобиновой фракции путем спиртового -осаждения, а альбумин элюируют с колонки буфером, содержащим 20 г/л хлорида натрия.