Способ получения рекомбинантного альфа-2 интерферона человека

Способ получения рекомбинантного альфа-2 интерферона человека

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гомогенного альфа-2 интерферона человека медицинского назначения из микробиологического продуцента. Способ предназначен для использования в медицинской и микробиологической промышленности для производства альфа-2 интерферона человека, необходимого в медицине для лечения различных вирусных заболеваний, а также как препарата для комбинированного лечения онкологических заболеваний человека. Цель изобретения - ускорение способа и повышение выхода целевого продукта, что достигается путем получения альфа-2 интерферона человека из биомассы бактериального продуцента Pseudomonas putida VG-84, содержащего рекомбинатную плазмиду VG-3, используя разрушение клеток в лизатном буфере, удаление нуклеиновых кислот, осаждение белков сернокислым аммонием, предочистку гидрофобной хроматографии и выделение продукта иммуноаффинной хроматографии.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гомогенного альфа-2 интерферона медицинского назначения из биомассы бактериальных клеток, содержащих ген альфа-2 интерферона человека в составе рекомбинантной плазмидной ДНК. Способ предназначен для использования в медицинской и микробиологической промышленности для производства альфа-2 интерферона человека медицинского назначения. Цель изобретения ускорение способа и повышение выхода целевого продукта. Это достигается за счет того, что микроорганизмы лизируют буфером, содержащим 15-20% сахарозы, 5,0-5,5 мМ ЭДТА, 0,15-0,25 М натрия хлористого 10,0-10,5 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,0045-0,0055% тиодигликоля с рН 6,7-8,2 при температуре 3-5^оС, обрабатывают лизат полиэтиленимином до конечной его концентрации 0,25-0,35% гидрофобную хроматографию проводят на фенилсилихроме С-80, элюируют препарат 0,02-0,025 М фосфатным буфером с рН 6,5-7,0, иммуноафинную хроматографию проводят моноклональными антителами 5А6, а целевой продукт элюируют буфером, содержащим 0,1-0,15 М глицина и 0,3-0,35 натрия хлористого при рН 2,5-3,5. Способ осуществляют следующим образом. 715 г замороженной при -70^оС биомассы Pseudomonas putida VG-84 продуцента альфа-2 интерферона человека, полученной по известному способу, дробят механически на куски объемом 1-2 см³, загружают в реактор типа "Симакс", добавляют 3575 мл лизатного буфера (0,1 М ТРИС-HCl, 15-20% сахарозы, 5 мМ ЭДТА, 0,15-0,25 М натрия хлористого, 10-10,5 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,0045-0,0055% тиодигликоля, рН 6,7-8,2 и при температуре 3-5^оС) перемешивают в течение 1 ч. Лизированные клетки центрифугируют в течение 1 ч на центрифуге Бэкман J2-21 при скорости 10000 об/мин. Получают 3700 ил внутриклеточного экстракта белков. К полученному внутриклеточному экстракту белков добавляют 190 см³ 5%-ного раствора полиэтилимина до конечной концентрации 0,25%-0,35% и перемешивают в течение 1 ч. Суспензию центрифугируют в течение 30 мин в роторе JA-10 центрифуги Бэкман J2-21 при оборотах 10000 об/мин. Супернатант собирают, получают 3800 мл раствора. К полученному супернатанту в реакторе типа "Симакс" (объем 10 л) добавляют соль сернокислого аммония по 85% насыщения при контролируемом рН 7,2-7,9 (в процессе растворения происходит окисление раствора) и перемешивают в течение 2 ч или при необходимости ночь для формирования крупных агрегатов белков. Осадок собирают центрифугированием как ранее и растворяют в 4500 см³ 0,02 М фосфатного буфера с 3 М натрия хлористого. Получают 5000 см³ раствора нативного альфа-2 интерферона человека. Полученный раствор белков наносят на колонку К 100/45 "Pharmacia" (Швеция), содержащую 3000 мл фенилсилохрома С-80, уравновешенную 0,02 М фосфатного буфера с 3 М натрия хлористого при рН 6,5. Далее через колонку пропускают уравновешивающий раствор до достижения базовой линии контрольного оборудования для детекции белков типа UV-I "Pharmacia" (Швеция). Фракцию альфа-2 интерферона человека элюируют пропусканием 0,02-0,025 М фосфатного буфера рН 6,5-7,0. Этот и все предыдущие растворы стерилизуют и очищают от пирогенов ультрафильтрацией через кассету фильтров типа РТGC 0005 (предел пропускания 10000 дальтонов) на системе типа "Pelicon" "Millipore" (США), а весь процесс с этой стадии проводят в стерильных условиях. Скорость элюиции на колонке 4 л/ч. Собирают фракцию альфа-2 интерферона человека. Сорбент регенерируется отмыванием десятикратными объемами воды, 35% изо-пропилового спирта, 75% изо-пропилового спирта, 35% изо-пропилового спирта, воды. Приготовление иммунного сорбента. 171 г активированной сефарозы суспендируют в 1 л 0,001 М соляной кислоты, перемешивают в течение 2-3 мин, после чего суспензию переносят на стеклянный фильтр и промывают 39,3 л раствором 0,001 М натрия хлористого, 2,88 г лиофильно высушенных моноклональных антител 5А6 растворяют в 576 см³ 0,1 М раствора NaHCO₃ рН 8,3 с добавлением 0,5 М натрия хлористого и перемешивают механической мешалкой при комнатной температуре в течение 2 ч при оборотах мешалки 100 об/мин. После перемешивания суспензию переливают на стеклянный фильтр, раствор отсасывают, сорбент обрабатывают 1,0 л 1 М раствора этаноламина рН 8,0 и перемешивают 2 ч в тех же условиях при комнатной температуре. Сорбент переносят на стеклянный фильтр, раствор отсасывают, а сорбент обрабатывают 1 л 0,1 М раствора натрия уксуснокислого с добавлением 0,5 М натрия хлористого. Суспензию иммуносорбента переносят на стеклянный фильтр и промывают 5 л 0,1 М раствора натрия уксуснокислого с добавлением 0,5 М хлористого натрия, рН 8,3, промывают 5 л раствора А, содержащего 8,0 г/л натрия хлористого, 0,2 г/л калия хлористого, 1,15 г/л натрия фосфорнокислого двухзамещенного, 0,2 г/л калия фосфорнокислого однозамещенного рН 7,2, затем 2 л раствора А с добавлением 0,002% мертиолата. Степень пришития моноклональных антител к сорбенту составляет 0,95. Полученный сорбент загружают в колонку К 100/45 "Pharmacia" (Швеция) и промывают 3 л раствора А со скоростью 2,0 л/ч. На колонку с той же скоростью наносят 5000 мл раствора белков, полученного как описано выше, колонку промывают 1,5 л раствора А, 1,5 л раствора А с добавлением 0,5 М натрия хлористого и 1,5 л раствора А. Десорбцию альфа-2 интерферона с иммуносорбента проводят 0,1-0,15 М глицинового раствора с 0,3-0,35 М натрия хлористого, рН 2,5-3,5. Десорбированный белок при помощи сенсора уровня коллектора FRAC 300 "Pharmacia" (Швеция) собирают в отдельные фракции. Фракции, содержащие альфа-2 интерферон (0,91 л), объединяют. Регенерацию иммунного сорбента с моноклональными антителами проводят пропусканием через колонку 3 л 0,15 М водного раствора натрия хлористого с последующей промывкой колонки 5 л раствора А. П р и м е р 1. Лизис клеток микроорганизмов проводят, как описано выше. В лизатном буфере содержалось 15% сахарозы, 5 мМ ЭДТА, 0,2 М натрия хлористого, 10 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) и 0,0045% тиодигликоля при рН 4,9 и температуре 3^оС. Лизат обрабатывают полиэтиленимином до конечной его концентрации 0,25% После фракционирования смеси белков сернокислым аммонием проводят гидрофобную хроматографию и элюируют препарат пропусканием 0,02 М фосфатным буфером с рН 6,5. Далее проводят очистку препарата иммуноаффинной хроматографией и элюируют целевой продукт 0,1 М глициновым раствором с 0,3 М натрия хлористого с рН 3,0. Выход целевого продукта в равен 88,7, активность его 3,7 10¹⁰ МЕ. П р и м е р 2. Лизис клеток ведут в лизатном буфере, содержащем 17,5% сахарозы, 5,2 мМ ЭДТа, 0,15 М натрия хлористого, 10,2 мМ ФМСФ и 0,0045% тиодигликоля при 3^оС, рН 6,7. Обработку полиэтиленимином проводят до конечной концентрации 0,3% Гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме М-80 проводят с применением элюирующего 0,022 М фосфатного буфера рН 6,7. Иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с моноклональными антителами проводят с применением элюирующего буфера рН 2,5, содержащего 0,12 М глицина и 0,32 М натрия хлористого, и регенерируют 0,17 М водным раствором натрия хлористого. Выход целевого продукта составляет 87,5% а активность его 3,5 10¹⁰ МЕ. П р и м е р 3. Лизис клеток проводят в лизатном буфере, содержащем 20% сахарозы, 5,5 мМ ЭДТА, 0,25 М натрия хлористого, 10,5 мМ ФМСФ и 0,0055% тиодигликоля при 5^оС, рН 8,2. Обработку полиэтиленимином проводят до конечной концентрации 0,35% Гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80 проводят с применением элюирующего 0,025 М фосфатного буфера рН 7,0. Иммуноаффинную хроматографию на сорбенте с моноклональными антителами проводят с применением элюирующего буфера рН 3,5, содержащего 0,15 М глицина и 0,35 М натрия хлористого, и регенерируют 0,2 М водным раствором натрия хлористого. Выход целевого продукта равен 87% а активность его 3,78 10¹⁰ МЕ. Гомогенность полученного препарата альфа-2 интерферона человека подтверждена электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, а также ультрацентрифугированием. В полученном препарате альфа-2 интерфероне человека прослеживается одна полипептидная цепь с N-концевой аминокислотой последовательностью Cys-Asp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser, определенной автоматически секвенированием по методу Эдмана в модификации Чанга. Эта последовательность, а также аминокислотный состав полученного альфа-2 интерферона полностью идентичны природному альфа-2 интерферону человека. Биологическая активность препарата, определенная на первичных фибробластах человека с использованием вируса везикулярного стоматита, составляет 4,0 10⁸ международных единиц (МЕ) на 1 мг белка. Применение описанной технологической схемы позволяет увеличить выход активности альфа-2 интерферона человека до 88,7% масштабировать процесс в 4,3 раза и получить альфа-2 интерферон человека за цикл 3,7 10¹⁰ МН (по сравнению с известным 8,6 10⁹ МЕ). Поскольку выделение продукта увеличивается в 4,3 раза (с 8,6 10⁹ МЕ до 3,7 10¹⁰ МЕ), тем самым время выделения убыстряется в 4,3 раза.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА путем лизирования клеток Pseudomonas putida несущих рекомбинантную плазмиду, обработки полученного лизата полиэтиленимином с последующим фракционированием сернокислым аммонием и очисткой гидрофобной и иммуноаффинной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения выхода целевого продукта, клетки микроорганизмов лизируют буфером, содержащим 15-20% сахарозы, 5,0-5,5 мМ ЭДТА, 0,15 0,25 М натрия хлористого, 10,0-10,5 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,0045-0,0055% тиодигликоля с рН 6,7-8,2 при температуре 3-5^oС, обрабатывают лизат полиэтиленимином до конечной его концентрации 0,25-0,35% гидрофобную хроматографию проводят на фенилсилохроме С-80, элюируют препарат 0,02-0,025 М фосфатным буфером с рН 6,5 7,0, иммуноаффинную хроматографию проводят моноклональными антителами 5А6, а целевой продукт элюируют буфером, содержащим 0,1-0,15 М глицина и 0,3-0,35 натрия хлористого при рН 2,5-3,5.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2004

(73) Новое наименование патентообладателя:ЗАО "Сикор Биотех" (LT)

Извещение опубликовано: 20.04.2004