Металлопротеиназа

Металлопротеиназа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к энзимологии, касается получения нового протеолитического фермента и может найти применение в медицине при лечении ран, ожогов, других повреждений кожи и для получения культуры клеток. Целью изобретения является получение нового фермента и удешевление его за счет простого способа выделения. Металлопротеиназа, выделенная из бактерий XANTOMONAS SP. ВКМ В-124, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства : активность гомогенного фермента 10,5 ТЭ/мг белка, молекулярная масса 28000±2000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе G-75), оптимум молярности 0,01 - 0,05 М, оптимум температуры реакции 60°С, оптимум PH 8, термостабильность - активность падает с 50°С, константа Михаэлиса - 3,2 мг/мл (субстрат - казеин), ингибиторы - ЭДТА (5 .10 -3 М) на 95%, не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаз, катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ЭДТА.

СООЗ СОЮЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

aeSUnn 1594 И)5 С 1209

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

f10 ИЗОЮКТКНИЯМ И ОТНРЫтИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1. (21) 3099360/30-13 (22) 04. 10.84 (46) 23.09.90. Вюл. У 35 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) А.И.Северин, О.А.Степная и И.С.Кулаев (53) 577. 15{088.8) (56) Stepanov N.N. et al. Biochem,.

Biophys. Res. Commun. 1977, р. 298305.

Алексеева В.В. Получение гомоген ной нейтральной бактериальной протеиназы Bacillus зиЬй111з — шт. 103 и изучение ее свойства. Автореф. дис. на соиск. учен. степени кан.техн, на- ука - N.: ИГИИМП, 1977.(54) МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА (57).Изобретение относится к биотехнологии, а именно к энзимологии, касается получения нового протеолитического фермента и может найти применение в медицине при лечении ран, Изобретение относится к биотехно" логии, а именно к энзимологйи, касается получения нового фермента, относящегося к протеолитическим фер- ментам и может найти применение в медицине при лечении ран, ожогов, других повреждений кожи и для иолу чения культуры клеток.

Целью изобретения является нолучение нового фермента, обладающего .таким комплексом свойств, который за счет простого способа выделения, позволяет получить дешевый фермент.

2 ожогов, других повреждений кожи и для получения культуры клеток. Целью изобретения является получение нового фермента и удешевление его за счет .простого способа выделения. Иеталло.протеиназа, выделенная из бактерий

-Xantomonas sp. ВКИ В-124, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства: активность гомогенного фермента 10,5 ТЭ/мг белка, молекулярная масса 28000%2000 (при определении методом гельфильтра- . ции на сефадексе С = 75), оптимум молярности 0,01-0,05 М, оптимум температуры. реакции 60 С, оптимум рН 8, термостабильность †. активность падает с 50 С, константа Хиказлиса

3,2 мг/мл (субстрат - казеин), ингибиторы — ЭДТА (15х10 И) íà 95Х, не ингйбируется ингибиторами сериковых и тиоловых протеаз, катионы двухва лентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ЭДТА. 6 табл.

Изобретение заключается в том, что бактерию Xantomonas sp. ВКМ

В-124 выращивают на питательной.среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, а целевой продукт. выделяют из культуральной среды asвестными методами.

Из известных методов могут быть использованы дробное осажпение ацето ном, фракционнрование сульфатом ам мония, )ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе и хроматографию иа сефадексе 0-75.

15942

Полученный Фермент является электрофоретически гомогенным H имеет следующие характеристики: мол.м,28000++

+2000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе 0-75), оптимум молярности 0,01-0,5 И, изоэлектрическая точка 5,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле и носителе ти- 10 па амфолин с интервалом рН 3-10, оптимум температуры реакции,60 С, оптио мум рН 8,0 (в трис-НС1 буфере при

37оС субстрат - казеин), термоста9 о бильность при 40-46 С в течение

15 .мин 1007., активность падает с 50 С (в трис-НС1 буфере при рН 8,0), при

60 С - до. 507. (условня те же), константа Михаэлиса 3,2 мг/мл (субстрат— казеин), ингибиторы - ЭДТА (5х10 И) на 957, не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаэ, в частности диизопропилфторфосфатом (Sx10 М), катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ее ЭДТА.

Пример, В колбу емкостью

750 мл вносят 100 мл питательной среды состава, г/л:

Глюкоза 10, О

ЗО

Бактопентон 5,0

БВК 3,00

На НРО х 12 Н О 1,50

КНРО4. 0,3S

MgS04 х 7НдО 0135

ГеБО4 х 7Н эО О, 05

NaCl 0,35

Доводят рН среды до 7,0 раствором ИаОН, среду стерилизуют. В колбу вносят клетки культуры продуцента Xantomonas sp. BI

30 + 1 С на качалке (200 об/мин).

Бактериальные клетки отделяют цент- рифугированием при 3000 об/мин на центрифуге К-70. Для выделения металлопротеиназы фильтрат культуральо ной жидкости охлаждают до 4 С и проводят. дробное осаждение ацетоном.

К 1 об. (5 л) фильтрата культуральной жидкости добавляют охлажденный до 4 С ацетон, выдерживают 1 ч на б холоде, осадок отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют адетон иэ расчета 1,5 об. ацетона

55 на, 1 об. исходного Фильтрата культуральной жидкости, выдерживают 1 ч на холоду. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,5 л дис14 4 тиллированной воды и проводят осаждение белков сульфатом аммония. К раствору фермента добавляют сернокислый аммоний иэ расчета 60Ж насыще- ния, перемешивают 1 ч, осадок отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до

80Х насыщения, оставляют на ночь и определяют осадок при 13000 об/мин на центрифуге К-24. Осадок растворяют в 5 л дистиллированной воды, диализуют против дистиллированной воды, а затем — против 0,05И трис-HCl буфера, рН 8,0. Ратсвор металлопротеиназы в 0,05М трис-НС1 буфера (рН 8,0) наносят на хроматографическую колонку (5 х 60 см), заполненную ДЕАЕ сефадексом А-50 и уравновешенную тем же буфером. Элюирование фермента прово» дят градиентом концентрации хлористого натрия от -О, 02 до О, 3 N. Фермент элюируется с колонки при концентрации хлористого натрия 0,13М. Фрак-ции (150 мл), соответствующие актив ности фермента, собирают и концентрируют, диализуя раствор фермента против сухого полиэтиленгликоля мол.м.

20000. Сконцентрированный раствор

Фермента (3 мл) наносят на хроматографическую колонку (2,5 х 80 см) с сефадексом G-75 (тонкий), уравновешенным О, 1И трис-НС1 буфером, рН 7,S.

Элюирование Фермента проводят тем же буфером. Фракции, соответствующие активности фермента, объединяют, концентрируют диалиэом против полиэтиленгликоля. Фермент хранят замороженным при -40 С или в лиофильно о высушенном состоянии при -4 С. Прбтеолитическую активность определяют согласно известному методу в некоторой модификации по степени гидролиза казеина. Для этого к 1 мл 1Е-ного раствора казеина добавляют 1 мл

0,1М трис-НС1 буфера, рН 8;0 и 0,5 мл раствора фермента. Смесь инкубируют при 37 C до 20 мин и реакцию останавливают добавлением 1,5 мл 157-ной трихлоруксусной кислоты, отфильтровывают осадок и определяют поглощение при 280 нм на спектрофотометре

"СФ-26. За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37 С в течение 1 мин освобождает 1 мкг-эквивалент тироэина (ТЗ).

Термостабильность фермента определяют, выдерживая раствор фермента

5 15942 (4 мкг/мл) в течение 15 мин при различных температурах (табл. 4) . Затем раствор охлаждают до 37 С и

0,5 мл раствора фермента добавляют в реакционную смесь для определения остаточной активности.

Для определения зависимости активности фермента от температуры к

1 мл 1Х-ного раствора казеина добавляют 1,0 мл О,!М трис-HCl буфера, рН 8,0, выдерживают 20 мин при различных температурах и затем добавляют раствор фермента (0,5 мл) и смесь выдерживают от 5 до 20 мин в зависимости от температуры (табл. 2).

Определение изоэлектрической точки фермента проводят по известному методу, используя амфолины фирмы ЛВК с областью рН 3-6 и 3-10. Изофоку- 20 сировку ведут в столбиках полиакриламидного геля при 1-2 мА на трубку в течение 3-3,5 ч. После окончания изофокусировки гели извлекают из трубок, разрезают на 30 ч., каждую 25 часть заливают 1 мл О, 1 М хлористого натрия и оставляют на ночь. Затем в каждой пробе измеряют рН, активность фермента.

Для определения константы Михаэли- 30 са используют концентрацию казеина от 1 до 16 мг/мл при концентрациях фермента О, 66; О, 8; 1,3 мкг/мл.

Ингибирование активности фермента . определяют, инкубируя раствор фермента с ингибитором в концентрации 5" 10 N в течение 30 мин при 37 С, а затем 0,5 мл раствора фермента с ингибитором вносят в реакционную смесь.

Молекулярную массу фермента определяют двумя методами — гель-фильтрацией и дискэлектрофореэом. Для определения молекулярной массы фермента гельфильтрацией хроматографическую колонку (2,5х85 см) с сефадексом G-75 (тонкий) уравновешивают

О, 1 М трис-НС1 буфером, рН 7,5, хроматографию ведут в том же буфере, используя в качестве маркеров бычий сывороточный альбумин (67000), овальбумин (43000), химотрипсиноген

A(25000), цитохром (12400).

Определение гомогенности и молекулярной массы фермента проводят методом дискэлектрофореза в !ОХ-ном полиакриламндном геле в присутствии додецилсульфата натрия. В качестве маркеров используют те же белки, что и в случае гельфильтрации.

Формула изобретения

Металлопротеиназа, выделенная иэ бактерий Xantomonas sp. ВКМ В-124, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства: мол.м. 28000 2000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе

G-75„ оптимум молярности 0,01-0,05 М, изоэлектрическая точка 5,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле и носителе типа амфолин с интервалом рН 3-10, оптимум температуры реакции 60 С, рН оптимум 8,0 (в трис-НС1 буфере при 37 С, субстрат каэеин), термостабильность — активность падает

4 6

Выход гомогенного фермента составляет 3,97. от его содержания в культуральной жидкости. Активность гомогенного фермента 10,5

ТЭ

Я ° мг белка

Полученная таким способом металлопротеиназа является электрофоретически гомогенным ферментом и имеет следующие характеристики:

Мол.м. 28000+2000

Оптимум рЙ (табл. 1) 8,0

Изоэлектрическая точка 5 0

Оптимум температуры реакции (табл. 2), С

Оптимум молярности (табл.3),М О,01-0,05

Фермент стабилен (табл. 4) до температуры, С,50

Константа Михаэлиса (субстрат — казеин), мг мл 3 2

Ингибируе тся

ЭДТА, М 5 ° 10

Катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ее ЭДТА и по этой способности образуют ряд:

2+ + 2+ 2+ 2+ 2+

Са, Со, Ng, Sr, Мп, Zn г+

Ва, Cd (табл. 6).

Фермент не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаз (табл. 5).

Таблица1

Определение зависимости активности металлопротеиназы от рН рН 65 70 75 80 85 90

Активность

10, T3/мп 1,37

1,68 1,88 2,43 2,21

1,74

Таблица2

Определение зависимости активности металлопротеиназы от температуры

Температура, С 22 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Активность

10 .ТЗ/mr 0,95 1,77 2,70 3,87 4,92 7,08 9,25 1 1„74 15, 16 10,83 8,33 6,00 3,33*

Таблица 3

Определение зависимости активности металлопротеиназы от молярнос-,и трис-НС1 буфера, рН 8,0

Концентрация, моль 0,01

О 16- О 20 О 30

0,05

О, 025

Активность

10 ТЗ/мл

1,82 1,62 1,62

1,99

2, 10

Тaáëèöа4

Определение стабильности металлопротеиназы

Температура, 0С

27 32 37 40 46 50 55

Активность

10, ТЗ/мп

3,3 3,3 З,З 3,1 3,1 2,7 2,4 1,1 0,1 О

1594214 8 с 50 С (в трис-НС1 буфере при рН 8,0) (5i10 И) íà 95Х, не ингибируется ин.40-46 С в течение.,15 мин - 100X, гибиторами сериновых и тиоловых проо

60 С вЂ” до 503 (условия те же), кон- теаз, катионы двухвалентных металстанта Йихазлиса 3,2 мг/мл (субст- 5 лов восстанавливают активность феррет - казеин), ингибиторы - ЭДТА мента после ингибирования ее ЭДТА.

1594214

Таблиц а5

Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы

Активность Ингнби0, Т3/мп Рование, Х

Ингибитор

Конце ингиб мол

П р и м е ч а и и е. ДИФ - диизопропилфторфосфат, ФИСФ - фенилметилсульфонилфторид» пХМБ - хлормеркурийбензоат ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксуеной кислоты.

Таб лица 6

Восстановление активности металлонротеиназы катионами двухвалентных металлов

Са СО" Ng Sr Мн" Еп" Ва Cd

Катион

34,0 23,0 17,0 13,2 12,1 9,9 9,1 . 7,5

Составитель И. Привалова

Редактор H. Рогулич Техред А. Кравчук . Корректор

Заказ 2814 Тираж 480 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 1О1

Контроль

ДИФ

ФЮФ

llXMS

ЗДТА

Восстановление активности

5 10

5 10

5 ° 10

5 10

3,0

2,5

3,0

3,2

0,25

0