Способ получения экзотоксина а pseudomonas aeruginosa

Способ получения экзотоксина а pseudomonas aeruginosa

Реферат

 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. Цель изобретения - упрощение способа и повышение степени очистки целевого продукта. Способ включает проведение процесса на полусинтетической питательной среде с добавлением 7,5% дрожжевого диализата. Среду предварительно очищают от высокомолекулярных компонентов ультрафильтрацией на полых волокнах ВПУ-15. Культивирование проводят в ферментере в условиях аэрации и перемешивания. Полученную после культивирования токсинсодержащую культуральную жидкость осветляют методом микрофильтрации на микропористых капроновых мембранах с диаметром пор 0,2 мкм. Осветленную токсинсодержащую жидкость подвергают очистке и концентрированию в режиме ультра-диафильтрации с применением тех же волокон. Степень очистки экзотоксина от балластных примесей питательной среды 99,9%, выход целевого продукта составляет 84,2% от исходного. Способ технологичен и воспроизводим в производственных условиях. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антигена при производстве моноспецифических сывороток, диагностических препаратов, а также в атоксической форме в качестве вакцины для профилактики и лечения инфекций, обусловленных Pseudomonas seruginosa. Цель изобретения упрощение способа получения экзотоксина А синегнойной палочки и повышение степени очистки целевого продукта. Изобретение заключается в том, что предварительная очистка питательной среды, а также очистка и концентрирование токсинсодержащей жидкости осуществляются с применением баромембранных методов. П р и м е р 1. Полусинтетическую питательную среду, имеющую следующий состав: 0,3% KH₂PO₄, 0,2% (NH₄)H₂PO₄, 0,3% цитрата натрия, 0,4% цитрата аммония, 0,0001% FeSO₄^.7H₂O, 1% молочной кислоты, 0,001% лактата кальция, 7,5% диализата дрожжей, 0,2% глюкозы, содержание белка 280 мкг/мл, объем 10,5 л, при помощи перистальтического насоса подают в ультрафильтрационный разделительный аппарат АР-2, давление на входе 0,1-0,15 МПа, и собирают пермеат, который используют в качестве питательной среды для культивирования, содержание белка в среде 220 мкг/мл, объем 10 л. Полученную после культивирования токсинсодержащую культуральную жидкость осветляют методом микрофильтрации на плоскокамерных разделительных аппаратах, заправленных микропористыми капроновыми мембранами "Мифил" с диаметром пор 0,2 мкм. Осветленную токсинсодержащую жидкость при помощи перистальтического насоса подают в ультрафильтрационный разделительный аппарат АР-2, заправленный полыми волокнами ВПУ-15 с порогом пропускания 15 кДа. Рабочее давление в аппарате не должно превышать 0,2 МПа, полученный пермеат отбрасывают, а концентрат (объем 1 л, белок 3000 мкг/мл) подвергают двухкратной диафильтрации на этих же аппаратах диафильтрации на этих же аппаратах с пятикратным объемом физиологического раствора, полученный пермеат отбрасывается, а концентрат представляет собой очищенный концентрированный экзотоксин А синегнойной палочки в объеме 1 л с содержанием белка 1100 мкг/мл. Поэтапная характеристика способа представлена в таблице. Выбор мембран с порогом отсечения 15 кДа объясняется строением молекулы экзотоксина А, которая состоит из двух субъединиц с молекулярной массой 42 и 25 кДа, соединенных дисульфидной связью. Поскольку в процессе очистки эта молекула может легко разрушиться из-за непрочности дисульфидной связи, применять мембраны с большим размером пор нецелесообразно ввиду возможных потерь целевого продукта. Таким образом, предлагаемый способ является менее трудоемким за счет использования процесса ультрафильтрации для очистки питательной среды и открывает возможность ограничиться применением баромембранных методов разделения для очистки и концентрирования препарата, позволяет получить максимальное количество экзотоксина А без содержания компонентов питательной среды и сокращает время очистки. Выход целевого продукта составляет 84,2% от исходного, что свидетельствует о высокой степени очистки экзотоксина А.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНА А PSEUDOMONAS AERUGINOSA, включающий культивирование продуцента на полусинтетической питательной среде с добавлением 7,5% дрожжевого диализата с последующим осветлением бактериальной суспензии, очисткой и концентрированием экзотоксина ультрафильтрацией, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения степени очистки целевого продукта, перед культивированием питательную среду подвергают ультрафильтрации на полых волокнах с порогом отсечения 15 кДа, осветление бактериальной суспензии проводят микрофильтрацией на капроновых мембранах, а очистку и концентрирование ультрафильтрацией осуществляют на тех же полых волокнах в режиме диафильтрации.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 23.02.2001

Номер и год публикации бюллетеня: 10-2003

Извещение опубликовано: 10.04.2003