Способ культивирования штамма-продуцента вируса иммунодефицита человека i типа

Способ культивирования штамма-продуцента вируса иммунодефицита человека i типа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии и может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в том, что для культивирования клеточной линии, продуцирующей ВИЧ-1, используют питательную среду, содержащую в качестве добавки, стимулирующей рост клеток, сыворотку крупного рогатого скота, обаботанную полиэтиленгликолем и дополнительно подвергнутую замораживанию-оттаиванию. Способ позволяет получить 15 л культуральной жидкости за 1 пассаж при роллерно-суспензионном культивировании. Способ может быть использован для производства диагностических препаратов ВИЧ-1. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) (g))g С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К дSTOÐCÍÎMÚ СВИДЕТЕЛ СТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4604992/30-13 (22) 10. 11.88 (46) 07.10.90. Бюл. К 37 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии

"Вектор" (72) M.À.Aíäðååâà, О.А.Мамаева и О.А.Плясунова (53) 578.085.23(088.8) ! (56) Игудин Л.И. и др. Способ очистки сыворотки KPC. — Вопросы вирусологии, !980, У 5, с. 640.

Патент США К - 4647773, кл. С 12 N 5/00, 1987. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА—

ПРОДУЦЕНТА ВИРУСА ИММУНОДЕФ11ЦИТА

ЧЕЛОВЕКА I ТИПА (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии и вирусологии, может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов.

Целью изобретения является удешевление способа.

При культивировании штамма — продуцента вируса иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-I) в качестве необходимого компонента питательной сре ды используют сыворотку крупного рогатого скота (КРС), обработанную полиэтиленгликолем мол. массой 6000 (конечная концентрация 8-97), с дополнительным многократным замораживанием — оттаиванием сыворотки.

2 нологии и вирусологии и может быть использовано при производстве диагностических и профилактических вирусных препаратов. Целью изобретения является удешевление способа. Способ заключается в том, что для культивирования клеточной линии, продуцирующей ВИЧ-1, используют питательную среду, содержащую в качестве добавки, стимулирующей рост клеток, сыворотку крупного рогатого скота, обработанную полизтиленгликолем и дополнительно подвергнутую замораживанию— оттаиванию. Способ позволяет получить

15 л культуральной жидкости за 1 пассаж при роллерно-суспензионном культивировании. Способ может быть испольЮ зован для производства диагностических препаратов ВИЧ-1. 2 табл.

С:

Физико-химические и биохимические показатели сывороток представлены в табл. 1.

Данные табл. 1, представленные по результатам не менее пяти экспериментов, показывают, что очищенная сыворотка не содержит у-глобулиновой фракции и по ряду показателей приближена к сыворотке крови плодов коровы.

В

Влияние питательной среды, содержащей очищенную сыворотку КРС, на вирус- а продукцию культуры клеток, хронически инфицированных ВИЧ-I представлено в табл. 2 (по результатам 5 серий).

Результаты табл. 2 показывают, что использование предлагаемой среды, содержащей очищенную сыворотку крови

КРС, не приводит к изменениям пара159738.8 метров культуры клеток по сравнению со средой известного способа, содержащей сыворотку крови плодов коровы

"Flow". На протяжении 24 пассажей уровень вируспродукции клеток на питательных средах с очищенной сывороткой KPC остается на том же уровне, Р что и на средах, содержащих контроль-! ную сыворотку. 10

Способ культивирования моноцитар ной линии клеток — продуцентов ВИЧ-I с использованием предлагаемой питательной среды отработан в лабораторных условиях на роллерной установке 1 в роллерно-суспенэионном режиме (объем 30 л).

Пример 1. Очистка сыворотки KPC.

Кровь KPC собирают в убойном цехе. 20

Коагулированную кровь отстаивают при

4 С, течение 48 ч для оптимального ь сбора сыворотки. К 20 л сыворотки, отделенной от сгустка крови, медленно с перемешиванием добавляют 40%-ный 25 водный раствор полиэтиленгликоля мол. массой 6000 до конечной концентрации

8%. Затем смесь отстаивают при 4о С в течение 17-20 ч. Супернатант собирают в стеклянные бутыли емкостью

0,5 л и замораживают. После замораживания сыворотку оттаивают и вновь подвергают замораживанию. Цикл замораживание — оттаивание повторяют

4 раза, сыворотку отфильтровывают через ватно-марлевый фильтр, анализируют на фракционный состав (табл. 1) и подвергают стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром йор 0,22 мкм. Очищенную таким обра- 40 зом сыворотку используют для культивирования клеток — продуцентов

ВИЧ-I.

Пример 2. Очистку сыворотки

KPC проводят аналогично примеру 1, 45 но к сыворотке добавляют полиэтиленгликоль до конечной концентрации

9%, а цикл замораживания — оттаивания повторяют 3 раза.

Пример 3. Культивирование клеток — продуцентов ВИЧ-I

Во флакон со средой RPMI-1640 ,стерильно после добавления антибиотиков (гентамицин 160 мкг/мп и лин. комиции в конечной концентрации

0,06X) и глютамина до конечной концентрации 0,03% вводят очищенную сы воротку КРС в следующем объемном соотношении компонентов, %: среда

85 сыворотка 15.

Культивирование моноцитарной линии клеток — продуцентов ВИЧ-I проводят при посевной концентрации 8 х х 10 кл/мл в роллерных пластиковых бутылях объемом 2 л при соотношении жидкой и газовой фаэ 1:5 соответственно, частоте вращения роллера 1

2 об/мин и температуре 36,5+0 5 С.

При пересеве клеток — продуцентов

ВИЧ-I через 4-6 сут инкубации половину объема суспензии клеток сливают для дальнейшего использования, добавляют такой же объем свежей питательной среды роста и инкубируют в тех же условиях.

Выход вируссодержащей культуральной жидкости с одной роллерной установки (76 роллерных бутылей) за один пассаж составляет 15 л. Урожай собирают на протяжении 24 пассажей.

Пример 4. Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но используют питательную среду, содержащую 15 об.% сыворотки крови плодов коровы "Flow". Результаты вируспродукции клеток представлены в табл. 2.

Пример 5. Культивирование клеток — продуцентов ВИЧ-I

Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но используют питательную среду, содержащую

7,5 об.X очищенной сыворотки KPC u

7,5 об.% сыворотки крови плодов коровы "Flow". Результаты вируспродукции клеток на питательной среде с частичной заменой сыворотки крови коровы по сравнению с известным способом {табл. 2): морфология клеток нормальная; индекс пролиферации

2,10+0,18; доля живых клеток 69,4t

-0,05; доля ВПК.по НИФ 4-40,%; титр

ИФА 1/(64 .17), показывают, что использование среды с частичной заменой сыворотки "Flow" не приводит к изменениям параметров культуры клеток.

Пример 6. Культивирование клеток проводят аналогично примеру 3, но питательная среда содержит t5 об.% сыворотки КРС. Результаты использо- . вания такой питательной среды отрицательны. Роста клеток — продуцентов ВИЧ-I не наблюдают.

Формул а и з о бр е т е ни я

Способ культивирования штамма —продуцента вируса иммунодефицита человека I типа на стандартной пита.тельной среде с добавлением сыворотки крови, отличающийся

Та блица 1

Показатели

Сыворотка

Очищенная сыворотка

КРС*

Плод коровы

0,16+0,02

30, 00+14, 00

0,1910,03

36,0023, 10

0,39+0,08

74,801 8,60

56,7044 50

30,80+3,60

12,50+2,80

Отсутствует

35,50 т 5,10

12,7О t 2,20

12,40 3,40

32,40 = 3,20

72,23+1,77

16,27+1,35

11,49+3, 12

Отсутствует

0,56 + 0,14

0,27 1 0,06

0,37+0,03

* Сыворотку КРС обрабатывают 8-9%-ным полиэтиленгликолем с 3-4-кратным замораживанием — оттаиванием.

Таблица 2

Среда Содержание сыворотки, %

Предлагаемая 15

Известная

Нормальная

2,22+0,47 71,7М,06

1/(91 432)

1/(100i34) 10-30

10-30

2,11+0,57 70,8+0,04

То же

П р и м е ч а н и е. ВПК вЂ” вируспродуцирующие клетки; НИФ вЂ” непрямая иммунофлуоресценция; ИФА — иммунофлуоресцентный анализ.

Редактор И.Дербак

Заказ 3032 Тираж 486 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,101

Прозрачность, ед.опт.плот.

Общий белок, r.ë -

Фракционный состав белков, % альбумин

e(-глобулин р -глобулин г-глобулин

Остаточный гемоглобин, r. л-"

597388

6 тем, что, с целью удешевления способа, иэ сывороток используют сыворотку крупного рогатого скота, которую перед употреблением обрабатывают 8-9%-ным полиэтиленгликолем мол. массой 6000 и подвергают 3-4-кратному замораживанию — оттаиванию.

Морфоло- Индекс Доля живых Доля ВПК, Титр ИФА гия кле- проли- клеток, Ж % по НИФ ток ферации

Составитель И.Тареева

Техред M.Äèäûê Корректор Л.Пилипенко