Способ определения липазы
Иллюстрации
Реферат
Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения - повышение чувствительности. Способ определения липазы посредством воздействия на субстрат липазы с образованием хромогена предусматривает использование субстрата общей формулы X-CO-A-CO-Y-CH<SB POS="POST">2</SB>-CH(Y-R)-CH<SB POS="POST">2</SB>-Z-R<SB POS="POST">1</SB>, где A - алкильная или алкиленовая группа с 2 - 12 C-атомами, R и R<SB POS="POST">1</SB>, которые могут быть одинаковыми или разными, каждый обозначают алкильную группу с 6 - 18 C-атомами, один из остатков R и R<SB POS="POST">1</SB> также обозначает атом водорода. X - резоруфин, 6-метилрезоруфин, 4,6-диметилрезоруфин, 1,6-диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин и 8-бромрезоруфин и каждый Y и Z, независимо друг от друга обозначают -S- или -О-, Z также обозначает -CH<SB POS="POST">2</SB>-. Количество освобожденного ароматического гидроксильного или тиолового соединения непосредственно или после сочетания с подходящим хромогеном оптически определяют по получившейся окраске. 3 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
ВСЕСОВ
ИТЕНТИО- f,"БИБЛ 9
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
0 0
ll ll
К С-Y-С-А — С-Х
Ь
HC-)Г-В.
Нас-Z-Ri
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 4027411/30-13 (22) 30.04.86 (31) P 35160012 (32) 03.05.85 (33) ОЕ (46) 30.10.90. Бюл. И 40, (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Ульрих Нойманн, Мартина аннус и Ханс-Георг Батц (ВЕ) (53) 543.8 (088.8) (56),Henning F. Proelss and Billy
Mright Lipoxygenic Micromethod for
Specific Determination of Lipase
Activity in Serum . and Duodenal
Fluid. Clinical Chemistry v. 23, Р 3, 1977, р. 522-531.
Shigeru Kurooka, et al. А. Novel
and Simple Colorimetric Assay for "
Numan Serum Lipase. J. Biochem., ч. 81, К- 2, 1977, р. 361-369. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПАЗЫ (57) Изобретение относится к =налитической химии. Цель изобретения — повыИзобретение относится к аналитической химии и имеет огромное значение для клинической химии, биохимии, фармацевтической химии и химии пищевых продуктов.
Цель изобретения — повьппение чувст" вительности определения, . Изобретение предусматривает использование в качестве субстрата липазы соединение общей формулы,.SU„„1604167 А 3 (5l)5 01 N 33/48//С 12 N 9/20
2 шение чувствительности. Способ определения липазы посредством воздействия на субстрат липазы с образованием хромогена предусматривает использование субстрата общей формулы
Х-СО-А-СО-7-СН -CH(Y R)-СН -Z R1 где
А — алкильная или алкиленовая группа с 2-12 С-атомами, R и R<, которые могут быть одинаковыми или разными, каждый обозначает алкильную группу с 6-18 С-атомами, один иэ остатков R u R < также обозначает атом водорода, Х вЂ” реэоруфин, 6-метилреэоруфин, 4,6-диметилрезоруфин, 1,6-диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин и
8-бромрезоруфин и каждый Y u Z независимо друг от друга обозначают
-S- или -0-, Z также обозначает -СН вЂ” .
Количество освобожденного ароматического гидроксильного или тиолового соединения непосредственно или после сочетания с подходящим хромогеном оптически определяют по получившейся окраске. 3 табл.
1 где А — алкильная или алкиленовая группа с 2-12 атомами углерода;
1604167
R u
R - одинаковые или разные, каждый означает алкильную группу с б-!8 атомами углерода, один из остатков R u R также атом водорода;
Х вЂ” резоруфин, б-метилрезоруфин, 1,6"диметилрезоруфин, 8-этилрезоруфин, 8-бромрезоруфин;
Y u Z — каждый независимо друг от друга означают -S- или
-О- 2 также -СНt Ф и оптическое определение по окраске количества освобожденного ароматического гидроксильного или тиолово" го соединения непосредственно, или после сочетания с подходящим хромогеном.
Для R и Б. предпочитают алкильные группы в противоположность ацильным группам, так как они не чувствительны к гидролизу.
Примерами для R и/или R являются остатки метила, этила, пропила, 25 бутила, пентила, гексила, гептила, октила, нонила, де4ила, ундецила, додецила, тетрадецила, гексадецила и октадецила как алкильные группы, а также соответствующие ацильные группы, как группы ацетила, пропионила, бутирила, валерила, капронила, каприла, капринила, лаурила, миристила, пальмитила и стеарила, олеила, кротонила, линолила, фенила, бензила или октилфенила.
Далее предлагаемый субстрат липазы содержит остаток дикарбоновой кислоты СООН-А-СООН, в которой А имеет предпочтительно 3-7 С-атомов.
Кислотами, образующими А, являются малоновая, янтарная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, пробковая азелаиновая, себациновая, нонандикарбоновая, декандикарбоновая и ундекандикарбоновая кислоты. Предпочитают кислоты от глутаровой кислоты до азелаиновой кислоты, которые соответствуют А с 3-7 С-атомами.
Х может быть ароматическим окси>О или тиолсоединением, которое представляет хромофор или может быть переведено в красящее вещество лишь последовательной реакцией. Типичными при-. мерами являются фенол„ тиофенол, нафтол, тионафтол и их производные,а также хромогенные соединения, как остаток резоруфина, б-метилрезоруфин, 4,б-диметилрезоруфин, 1,6-диметилре-" зоруфин и 8-этилрезоруфин, и 8-бромрезоруфин, хлорфенолового красного, индоксила или тиофлуоресцеина. !
Предпочитают хромофоры, которые имеют небольшую полярность и являются жирорастворимыми. Однако при этом должна быть гарантирована еще водорастворимость.
Жирорастворению названных хромофоров способствует подходящее замещение с алкильными группами, Так, для остатка резоруфина оказались группы метила, диметила и этила, а также замещение с бромом.
Соединения по изобретению являются новыми. Они имеют асимметрический центр и поэтому оптически активны. В качестве субстрата липазы можно применять как образующиеся при обычных методах получения рацематы, так и оптические изомеры.
Субстраты липазы по изобретению можно получать известными методами.
Способ предусматривает использование в составе аналита реактива, предпочтительно содержащего, мг/мл: субстрат 0,05-10, дезоксихолат 2-50, колипаза 0,001-0,01, мочевина 1-100, NaC1 0,1-10, буфер 1-50, устанавливающие рН QT б до 10,5 соответственно в пересчете на годный к упбтреблению раствор.
Приведенные примеры иллюстрируют как получение субстратов, так и способы определения липаэы с их использованием.
Пример 1. а) Сложный моноэфир 1,2-0-дигексил-рац-глицеро-3глутаровой кислоты.
В раствор 3,3 г (11,5 ммоль) 1,2О-дигексил-глицерина в 30 мл хлороформа добавляют последовательно
2,5 мл пиридина, на кончике шпателя
4-диметиламинопиридин и 2,6 г (23 ммоль) ангидрида глутаровой гислоты. Смесь нагревают 10 ч при флегме и после охлаждения разбавляют
200 мл хлороформа. Фазу хлороформа взбалтывают с 1 н. соляной кислотой и сушат. После отфильтровывания высушивающего вещества растворитель удаляют и остаток очищают на колонне с силикагелем (элюент: уксусный эфир — петролейный эйир 1:1).
ДС: Rf = 0,45 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2 + 1% ледяной уксусной кислоты), 7 6 ного перемешивания при комнатной температуре фильтруют и удаляют растворитель. Переработка аналогична приме. ру l c.
ДС: Rf = 0,66 (уксусньп" эфир— гексан 1:1).
Пример 3 ° а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру la из 3,2 г (10 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина и 2,1 г (15 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf = 0,61 (уксусный эфир— петролеиный эфир 1:1), IR (см ):(ïëåíêà):1740; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0диоктил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты, b), Получение аналогично примеру lb из 2,2 r (4,7 ммоль) За. с). Получение аналогично примеру
2с иэ. 1 г (4,7 ммоль) резоруфина, 0,7 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 3b.
ДС: М = 0,78 (уксусный эфир— гексан 1:2).
Пример 4. а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктил-рац-глицеро-3-азелаиновой кислоты.
Получение аналогично примеру la из 6,3 г (20 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина, 80 мл хлороформа, 5 мл пиридина и 5,2 r (30 ммоль) ангидрида азелаиновой кислоты.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0диоктил-рац-глицеро-3-азелаиновой кислоты, b). Получение аналогично примеру lb из 3,2 г (6,5 ммоль) 4а и
3 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру 2с из 1,4 г (6,5 ммоль) резоруфина, 65 мл хлороформа, 1,1 мл 1,8диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 4Ь, ДС: Rf = 0,86 (уксусный эфир— гексан 1:2) °
IR (см "):(пленка) 1762; 1736, Пример 5. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-3глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру la из 3,7 г (10 ммоль) 1,2-0-дидецилглицерина, 40 мл хлороформа, 2,5 мл пиридина и 1,8 r (15,8 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
5 160416
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дигексил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты, Ь ) 1,4 r (3,7 ммоль)раствора
5 по способу la растворяют в 20 мл хлороформа и при охлаждении льдом закапывают 2 мл (23,3 ммоль) хлористого оксалила. Ледяную ванну удаляют и перемешивают раствор 12 ч при комнатной
I температуре. Затем сливают растворитель, остаток поглощают в толуоле и снова выпаривают. Полученное таким путем масло применяют без дальнейшей очистки. 15 с) 0,8 г (3,7 ммоль) резоруфина суспендируют в 40 мл диметилформамида при добавке 1,1 мл пиридина и на кончике шпателя 4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по спо- 20 собу lb в 20 мл диметилформамида.
После одно - и двухсуточного перемешивания при комнатной температуре фильтруют и сливают растворитель.
Остаток поглощают в уксусном эфире, 25 отфильтровывают нерастворимые компоненты и взбалтывают фильтрат с 1 н. соляной кислотой, затем с водой.
После сушки органической фазы и отгонки растворителя получают маслянистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем (элюент: уксусный эфир - петролейный эфир 1:1)
ДС: Rf = 0,70 (уксусный эфир— гексан 1:1)..
Пример 2. а). Сложный моноэфир 1,2-0-диоктнл-рац-глицеро-3глутаровой кислоты, Получение аналогично примеру lа 40 из 13 г (41 ммоль) 1,2-0-диоктил-глицерина, 150 мл хлороформа, 10 мл пиридина и 6,8 r (59,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты, Выход 6,5 г (37K).
ДС: Rf = 0,31 (уксусный эфир — петролейный эфир 1:1).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0диоктил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты, Ь). Получение аналогично примеру
1b из 2 r (4,5 ммоль) по примеру 2а. с). 0,96 г (4,5 ммоль) резоруфина растворяют в 50 мл хлороформа при добавке 0 75 мл (5 ммоль) 1 8-диазаЭ
55 бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 0,1 г
4-диметиламинопиридина. Туда закапывают раствор по примеру 2Ь в 20 мл хлороформа. После одно- и двухднев1604167
ДС: Rf 0,77 (уксусный эфир— гексан I:2).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой
5 кислоты
Ь). Получение аналогично примеру 1Ъ из 2,5 r (5 ммоль) 5а, 50 млхлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру 2с из 1,1 r (5 ммоль) резоруфина, 1 мл 1,8-диазабицикло-(5,4,0)ундец-7-ена и 5b
ДС: Rf = 0,70 (уксусный эфир— гексан 1:1). 15
Пример б. а). Сложный моноэфир 1,2-0"диундецил-рац-глицеро-3глутаровой кислоты, Получение аналогично примеру lа из 2 r { 5 ммоль ) 1,2-0-диундецилглицерина, 25 мл хлороформа, 1,4 мл пиридина и 0,9 г (7,5 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf 0,55 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2). 25
ХК (см ):(пленка) 1740; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0диундецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты
b). Получение аналогично приме- 30 ру lb из 2 r (3,9 ммоль) ба 5 мл хлороформа и 1,8 хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру 2с из 0,83 г (3,9 ммоль) резоруфина, 0,61 мл 1,8-диазабицикло-(5,4, О)-ундец-7-ена и 6Ь.
ДС: Ы = 0,47 (RP 18, этанол— ацетон 2:1).
Пример 7. а). Сложный моноэфир 1 2 0-дилаурил рац-глицеро-3- .40 глутаровой кислоты, Получение аналогично примеру la из 10,7 г (25 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 70 мл хлороформа, 5,5 пиридина и 3,3 г (29 ммоль) ангидрида 45 глутаровой кислоты.
ДС: Rf = 0,33 (уксусный эфир — петролейный эфир 1:1).
ХК(см )(пленка): 1741; 1 708, Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дилаурил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
b). Получение аналогично примеру 1Ь из 5,5 г (10 ммоль) 7а, 50 мл хлороформа и 4,3мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
2с из 2,2 г (10 ммоль) резоруфина, 100 мл хлороформа и 1,5 ил 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 7Ь.
ДС: Ы = 0,78 (уксусный эфир7йетролейный эфир 1 1).
IR (см-1)(пленка): 1765; 1720.
Пример 8. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3пимелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру la из
8,6 r (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-глицерина, 50 мл хлороформа, 15 мл пиридина и 4,3 г (30 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: ВХ = 0,5 (уксусный эфир— петролейный эфир l:2), И (см )(пленка): 1 740; 1 710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дилаурил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты.
b) . Получение аналогично примеру
lb из 1,66 r (3 ммоль) 8а и 1,3 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
2с из 0,65 г (3 ммоль) резоруфина, 30 мл хлороформа, 0 5 мл 1,8-диазабнцикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и Sb.
ДС: Rf = 0,75 (уксусный эфир гексан 1:1).
IR (см )(пленка): 1768; 1739.
Пример 9. а). Сложный моно- " эфир 1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеро3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру la из 14,6 r (30 .ммоль) 1,2-0-дитетрадецил-глицерина, 150 мл хлороформа, 8,2 мл пиридина и 5,1 г (45 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf = 0,42 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2).
IR (см ) (KBr): 1740;. 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дитетрадецил-рац-глицеро-3-глутаровой ки сл о ты
Ь). Получение аналогично примеру lb из 3 r (5 ммоль) 9а и 2,2 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
2с из 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 50 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8-диаза бицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 9Ь.
ДС: Rf = 0,34 (RP18, ацетонитрил— дихлорметан l:1), IR (см )(KBr)". 1763; 1735, Пример 10, а). Сложный моноэфир 1,2-0- дитетрадецил-рац-глицеро3-пимелиновог. кйслоты, Получение аналогично примеру 9а из 6,4 г (45 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
1
ДС: Rf = 0,45 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2).
IR (см )(пленка): 1740; 1708.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дитетрадецил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру
1Ь из 3,1 r (5 ммоль) 10а и 2,2 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру 2с из 1,06 r (5 ммоль) резоруфина, 50 мл хлороформа и 0,78 мл 1,8диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 10Ъ.
ДС: Rf = 0,71 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2)
IR (см )(пленка): 1755; 1734.
Пример 11. а). Сложньй моноэАир 1,2-0-дигексадецил-Sn-глицеро-3 глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру
la из 2,7 r (5 ммоль) 1,2-0-дигексадецил-Sn-глицерина, 50 мл хлорофор ма, 3 мл пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf = 0,65 (уксусный эфир— петролеиный эфир 1:1)
IR (см )(KBr): 1740; 1710, Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дигексадецил-Sn-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ъ). Получение аналогично примеру
1Ь из 2,2 r (3,3 ммоль) lla и 1 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру lс из 0,71 r (3,3 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 0,5 мл пиридина и llb.
ДС: Rf = 0,72 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:2).
Пример 12. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дибензил-рац-глицеро-3глутаровой кислоты, Получение аналогично примеру la из 3 г (11 ммоль) 1,2-0-дибензилглицерина, 30 мл хлороАорма, 2,5 мп пиридина и 1,8 г (16 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf = 0,39 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:1 + 1 ледяной уксусной кислоты).
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дибензил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты, Ь) . Получение аналогично примеру
1Ь из 2,9 г (7,5 ммоль 12а), 30 мп хлороформа и 3,3 мп хлористого оксалила.
604167 !О с), Получение аналогично примеру
2с иэ 1,6 r (7,5 ммоль) реэоруфина, 75 мл хлороформа, 1,2 мп 1,8 диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 1?Ь.
ДС: Rf = 0,48 (уксусный эфир гексан 1: 1) .
Пример 13. а) . Сложный моноэфир 1-0- о ктад ецил-2-0-б ен зил-Snглицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру 1а из 2, 2 r (15 ммоль 1-О-октадецил-2О-б ензил-Sn-глицерина, 50 мп хлороформа, 3 мп пиридина и 1,5 г (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
IR (см ) (пленка): 1730; 1700.
Сложный резоруфиновый эфир 1-0октадецил-2-0-б ензил-Sn-глицеро-3глутаровой кислоты.
20 Ъ). Получение аналогично примеру
lb из 1,7 г (3,1 ммоль) 13а и 1,3 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
lс иэ 0,8 г (37 ммоль) резоруфина, 25 20 мл диметилформамида, 0,7 мл пиридина и 13Ь.
ДС: Rf = 0,68 (уксусный эфир петролейный эфир 1:1).
IR (см ) (KBr): 1768; 1739.
30 Пример 14. а). Сложный моноэфир 1,2-диоктаноил-Sn-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру lа из 6,8 г (20 ммоль) 1 2-диоктаноилSn-глицерина, 100 мл хлороформа, 12,5 мл пиридина и 5,8 r (50 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ДС: Rf = 0,49 (уксусный эфир— петролейный зАир 1:1).
4р Сложный резоруАиновый эАир 1,2диоктаноил-Sn-глицеро-3-глутаровой кислоты
Ь). Получение аналогично примеру lb из 2,2 r (5 ммоль) 14а и 2,2 мл
45 хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
lс из 1,05 г (5 ммоль) резоруфина, 30 мл диметилАормамида, 0,75 мл пиридина и 14Ь.
ДС: Rf = 0,86 (RP18, ацетонитрил— дихлорметан 1:2).
Пример 15. а). Сложный моноэфир 1,2-диолеил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру la из 3,1 г (5.ммоль) диолеина, 40 мл хлороформа, 3 мл пиридина и 1,5 r (13 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты.
ll 160416
ДС: Rf 0,32 (уксусный эфир — петролейный эфир 1:1).
ZR (см )(пленка): 1740; 1706.
Диолеин можно получать в чистой
l форме из технического диолеина хроматографией на колонне с силикагелем при использовании уксусного эфира — петролейного эфира 1:3 в качестве растворителя. 10
Сложный резоруфиновый эфир 1,2диолеил-рац-глицеро-3-глут аров ой кислоты.
b), Получение аналогично примеру
1b из 3,5 r (4,8 ммоль) 15а и 1,3 мл 15 хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
lс из 0,9 г (4,2 ммоль) резоруфина, 20 мл диметилформамида, 1 мл пиридина 15Ъ. 20
ДС: Rf = 0,78 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:1).
Пример 16. Сложный нафтиловый эфир 1,2-0-дитетрадецил-рацглицеропимелиновой кислоты. 25
Получение осуществляют аналогично примеру 10Ь и с из 0,72 r (5 ммоль) 1-нафтола. Очистка Flashхроматографией на силикагеле с растворителем уксусным эфиром — гекса- 30 ном 1:3.
ДС: Rf = 0,89 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:5).
Пример 17. Сложный резоруфиновый эфир 1,2-диолеил-рац-глицеро3-глутаровой кислоты.
10,3 г (14,2 ммоль) сложного моноэфира 1,2-диолеил-3-глицеро-глутаровой кислоты по примеру 15а, 3,2 г (15 ммоль) резоруфина, 6,2 г 40 (30 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и на кончике шпателя 4-диметиламинопиридин перемешивают в 75 мл диметилформамида 2-3 дня при комнатной температуре. Затем разбавляют уксусным эфиром и осадок отфильтровывают. Фазу уксусного эфира взбалтывают с 1 н. соляной кислотой и сушат иад сульфатом натрия. После отгонки растворителя остается маслянистый остаток, который очищают хроматографией на колонне с силикагелем (растворитель:уксусный эфир — петролейный эфир 1:1).
Таким образом получают соответствующее производное хлорфенолового красного.
ДС: Rf = 0,69 (RP!8; изопропанол— метанол 1:2).
7 12
Пример 18. Получение сложного моноэфира 1,2-0-диоктил-3-пимелиновой кислоты.
Стадия 1: синтез сложного бензилового моноэфира пимелиновой кислоты.
Стадия 2: аналогично примеру 1Ь из 2,5 r (10 ммоль) сложного бензилового эфира пимелиновой кислоты; полученное масло закапывают в раствор 3,2 r (10 ммоль) 1,2-0-диоктилглицерина, 7 мл пиридина; обработка аналогично примь. lс.
Стадия 3: указанный продукт растворяют в 20 мл тетрагидрофурана и после добавки 0,4 г палладия — активированного угля гидрируют. Сырой продукт очищают на колонне с силикагелем; растворитель уксусный эфир— петролейный эфир 1:1, ДС: Рй = 0,61 (уксусный эфир— петролейный эфир ):1)
IR (см )(пленка): 1740; 1710.
Пример 19. Синтез сложного моноэфира 1,2-диолеил-глицеро-3-глутаровой кислоты. а). Сложный трихлорэтиловый эфир
1,2-0-изопропилиден-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Стадия 1: 5,55 г (42 ммоль) изопро= пилиденглицерина и 12 г (45,3ммоль)
2,2,2-трихлорэтил-гидро-глутарата растворяют в простом диметиловом эфире этиленгликоля и смешивают с !0,5 r (51 ммоль)дициклогексилкарбодиимида; после двухдневного перемешивания. фильтруют и подвергают перегонке", т.кип,, 170 С (0,1 торр), бесцветное масло.
ДС: Rf = 0,82 (ацетон — хлороформ
1:1).
Стадия 2: полученное масло растворяют в ll мл простого эфира, смешивают с 3 мл метанола и 3 мл 3 н. соляной кислоты и перемешивают 12 ч при комнатной температуре; органическую фазу встряхивают с насьпценным раствором бикарбоната натрия, затем с насыщенным раствором хлористого натрия и сушат; после удаления растворителя остается маслянистый остаток.
ДС: Ы = 0,23 (уксусный эфир — петролейный эфир 1:1).
Ъ) . Сложный трихлорэтиловый эфир
1,2-диолеил-.глицеро-3-глутаровой кислоты.
Стадия 3: 6,1 г (18 ммоль) полученного продукта и 7,84 r (38 ммоль) олеиновой кислоты растворяют в
l4
04167 активность 1 Е/мин активность стаьщарт . пробы (пробы)
Ь Е/мин (стандарт) где Ч з — общий подъем испытывае- з мой исходной смеси, см
V пробы — объем пробы, см
Я вЂ” коэффициент экстинкции хромогена при 578 нм;
Й - толщина слоя кюветы,см;. = 1000 ° — — — — -- Q Е/мин
V авщ
Я7 пробы
) 16
100 мл простого диметилового эфира этиленгликоля и закапывают раствор
10,5 г (37 ммоль)дициклогексилкарбодиимида в 50 мл простого диметилового эфира этиленгликоля; после
12-часового перемешивания при комнатной температуре фильтруют и последовательно встряхивают с 3 н. соляной кислотой с раствором бикарбоната натрия, затем с водой. После сушки и концентрирования органической фазы остаток хроматографируют на силикагеле.
Стадия 4: сложныи моноэфир 1,2диоленл-глицеро-3-глутаровой кислоты; отщепление защитной группы трихлорэтила осуществляют известным методом.
Г р и м е р 20. а) ° Сложный моноэфир 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-3пимелиновой кислоты.
Получение аналогично примеру lа из 5,6 r (15 ммоль) 1,2-0-дидецилглицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл пиридина и 4,0 г (28 ммоль) ангидрида пимелиновой кислоты.
ДС: Rf = 0,36 (уксусный эфир— гексан 1:1).
IR (см )(пленка): 1735; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дидецил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты, Ь). Получение аналогично примеру
1Ь из 3 r (5,8 ммоль) 20а, 50 мл хлороформа и 2,2 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру 2с из 1,1 г (5 ммоль) резоруфина, 1 мл (6,4 ммоль) 1,8-диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена и 20Ъ.
ДС: Rf = 0 71 (уксусный эфир— гексан 1:1).
IR (см )(пленка): 1755; 1720, Пример 21. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3азелаиновой кислоты.
Вычисление активности липазы пробы возможно также по следующей формуле: активность,,(ед./1) = (пробы) Получение аналогично примеру la иэ 6,7 г (15,6 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 100 мл хлороформа, 3,2 мл пиридина и 4,0 r (23 ммоль) ангидри-: да азелаиновой кислоты.
ДС: Rf = 0,22 (уксусный эфир— гексан 1:1)
IR (см )(пленка): 1738; 1710.
Сложный резоруфиновый эфир 1,2-0дилаурил-рац-глицеро-3-азелаиновой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру
1Ь из 1,5 r (2,5 ммоль) 2!а 30 мл хлороформа и 1,5 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
2с из 0,55 г (2,5 ммоль) резоруфина, 25 мл хлороформа, 0,5 мл
20 (3,2 ммоль) 1,8-диазабицикло-(5,4,0)ундец-7-ена и 21Ъ.
ДС: Rf = 0,78 (уксусный эфир— гексан 1:1).
IR (см )(пленка): 1762; 1740.
25 Пример 22. 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании l,2 г дезоксихолата натрия и 0,15 мл колипазы (от свиньи), При сильном перемешивании впрыскивают туда по возможности тонкой струей
70 мг субстрата липазы сложного ре зоруфинового эфира 1,2-0 †диоктилрац-глицеро-3-азелаиновой кислоты (пример 4) в 1,7 мл п-пропанола при давлении. Раствор, который в 200 мл дистиллированной воды содержит в растворенном виде 1,5 г мочевины, 1 г дезоксихолата натрия, 200 мг хлористого натрия, 800 мг TRIS u
107 мг TRIS — НС1 буфера хорошо смеУ .шивают с полученной выше эмульсией.
2,5 мл изготовленного таким путем раствора смешивают с 100 мл пробы (сыворотка). Реакцию проводят при
578 мм рт.ст. с показаниями на фотометре.
При известной по стандарту активности липазы вычисляют активность липазы пробы следующим образом:
Пример 24. 8,5 r дезоксихолата натрия, 0,05 r колипазы, 20 r маннита, 0,05 г хлористого кальция
У
0,82 r хлористого натрия, 2,7 г
TRIS и 0,4 r TRIS.НС1 растворяют в
200 мл дистиллированной воды. При перемешивачии впрыскивают раствор, который содержит в растворенной форме 0,35 r сложного нафтолового эфира 1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеро-3пимелинавой кислоты в 7 мл пропанола, Полученную таким путем эмульсию замораживают при -40 С и подвергают лиофилизации.
70 г полученного лиофилизата растворяют в 2 мл дистиллированной воды
160416
ЬЕ/мин - изменение экстинкции за 1 мин при 578 нм.
При названных условиях реакции коэффициент экстинкции составляет
Я = 60,65 см мкмоль
-1 5
Пример 23. Для различных субстратов липазы определены изменения величины холостого опыта, чувствительность эстеразы и липазы и корреляция к нефелометрическому тесту с помутнением.
Изменение величины холостого опыта определено с реактивом по примеру 1 и различными субстратами липазы.
Вместо пробы добавляли 100 мл воды и наблюдали по фотометру изменение экстинкции при 578 (мЕ/мин).
Для определения чувствительности эстеразы добавляли вместо пробы 20
100 мл карбоксилэстеразы (ЕС 3.1,1.1, около 20000 ед/л Берингер Маннхайм
ГмбХ, номер определения 10 46 98) и наблюдали, как описано выше, изменение экстинкции, 25
Для определения чувствительности липазы вместо пробы добавляли
100 мл липазы (ЕС 3.1.1.3, около
100 ед/л, Берингер Маннхайм ГмбХ, номер определения .41 45 90) и наблюдали, как описано выше, изменение экстинкции.
Для определения корреляции к не фелометрическому тесту с помутнением проводили с возрастающими количествами липазы (0-1000 ед/л) тест
35 с помутнением (Берингер Маннхайм
ГмбХ, номер определения 26 23 58), сравнивали с цветным тестом по примеру 22 и определяли коэффициент корреляции,, Результаты показаны в табл.1, 7 16 и смешивают с l00 мл TR-раствора красного паранитроанилина (красный паранитроанилин-4-хлор-3-метилбензолдиазоний-нафталин-l,5-дисульфонат) (231 мг в 10 мл дистиллированной воды).
После добавки 100 мл сыворотки наблюдают за реакцией при 405 нм по фотометру.
Определение концентрации липазы проводят по калибровочной кривой аналогично примеру 22.
Пример 25. В раствор 3,04 г тауродезоксихолата, 2,7 г поливоска
4000, 7 мг хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.
К полученной таким путем эмульсии добавляют следующий раствор и хорошо смешивают.
10 г тауродезоксихолата, 6,4 r поливоска, 50 г маннита, 14 r мочевины, 800 мг хлористого натрия и 15 r
ТРИС растворяют в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора соляной кислоты устанавливают рН 7,5. После этого раствор дополняют до 400 мл дистиллированной водой.
2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при
578 «чм по фотометру.
Оценку проводят, как в примере 22.
Пример 26. В раствор 3,04 r тауродезоксихолата, 2,7 r поливоска
4000, 7 мг хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от свиньи) в 120 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании 150 мг субстрата липазы сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дидецил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты в 3,5 мл п-пропанола.
К полученной таким путем эмульсии добавляют и.хорошо перемешивают следующий раствор.
10 г тауродезоксихолата, 6,4 поливоска, 50 г .маннита, 14 г мочевины, 800 мг хлористого натрия, 28 г буферного раствора CHES в 300 мл дистиллированной воды. При помощи раствора соляной кислоты устанавливают рН 8,5.
После этого дополняют раствор до
400 мл дистиллированной водой.
1604167 1S
2,5 мл полученной таким путем реакционной смеси смешивают с 100 мл сыворотки. Реакцию наблюдают при 5?8 нм по фотометру.
Оценку производят, как указано в примере 22.
Пример 27. В раствор из 4,0 r тауродезоксихолата Na, 0,06 г хлористого кальция, 0,2 мг колипазы (от свиньи), 5,0 r маннита и 2,0 г поливоска 4000 в 100 мл дистиллированной воды впрыскивают при перемешивании
150 мл сложного нафтолового эфира
1,2-0-дитетрадецил-рац-глицеро-3-пимелиновой кислоты, который растворен в 4 мл и-пропанола. При хорошем охлаждении полученную таким путем эмульсию обрабатывают несколько минут ультразвуком.
Второй раствор содержит в 100 мл
2,4 г тауродезоксихолата Na, 2,0 г
TRIS, 12,0 г маннита, 3,5 г мочевины и 0,5 r хлористого натрия. При помощи соляной кислоты устанавливают рН
8,3.
Третий раствор содержит 1 r красного паранитроаналина ТК (красный паранитроаналин TR 4-хлор-метил-бензол-, диазоний-нафталин-1,5-дисульфонат) в
40 мл дистиллированной воды в растворенной форме.
5 ч. раствора 1 и 6 ч. раствора
2 смешивают с 1 ч. раствора 3. Полученным раствором пропитывают пригодную для получения тест-полоски всасывающую бумагу, например, сорта, VS532 фирмы Шляйхер унд Шулл и осторожно сушат в камерной сушилке с цир, куляцией воздуха при температуре от
30 до 65 С.
До дальнейшего применения рекомендуется хранение в присутствии средства дегидратации.
Для испытания на липазу сыворотки .небольшое количество (несколько капель) ее наносят на полоску.
На основании кривой скрашивания в желтый цвет по времени можно сделать вывод об активности липазы исследуемой пробы.
Пример 28. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3тетрадекандикислоты.
Получение аналогично примеру la из 8,6 r (20 ммоль) 1,2-0-дилаурил-. глицерина, 100 мл хлороформа, 4 мл пиридина, 0,4 г диметиламинопириди5
1О
50 на, 9,6 r (40 ммоль) ангидрида двухосновнсй тетрадекановой кислоты.
ДС: R1 = 0,45 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:5), Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3тетрадекановой дикислоты.
b). Получение аналогично примеру 1Ь из 3,35 г (5 ммоль) 28а и
2,2 мл хлористого оксалила.
c). Получение аналогично примеру
2с из 1,2 r (5 ммоль) 4-метилрезоруфина, 20 мл хлороформа, 0,75 мл 1,8диазабицикло-(5,4,0)-ундец-7-ена, 0,1 г диметиламинопиридина и 28Ь.
ДС: R < = 0,63 (уксусный эфир— гексал 1:4).
d). Получают эмульсию, как указано в примере 22. Однако вместо названного субстрата липазы применяют раствор 70 мг субстрата липазы сложного (6-метилрезоруфинового) эфира
1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3-тетрадекановой дикислоты, растворенного в
1,7 мл п-пропанола.
При этом получены следующие тестспецифические параметры (cp. пример
23 и табл.1): величина холостого опыта 0,2 мЕ/мин; активность эстеразы
0,7 мЕ/мин; чувствительность липазы
23,6 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,09509.
Пример 29. Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1,2-0-дилаурилрац-глицеро-3-глутаровой кислоты. а). Получение аналогично примерам
76;с 2,3 r (10 ммоль). 4-метилрезоруфина.
ДС: R = .0,68 (уксусный эфир— гексан 1:2).
Ь). В 60 мл дистиллированной воды растворяют при перемешивании 0,9 г тауродезоксихолата натрия и 0,3 г колипазы (от свиньи). При хорошем пе" ремешивании впрыскивают туда раствор сложного (6-метилрезоруфинового) эфира 1,2-О-дилаурил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты, 70 мг в 1,7 мл ипропанола. Затем добавляют раствор (200 мл), который содержит в 200 мл
0,5 г мочевины, 1 г тауродезоксихолата натрия, 200 мл хлористого натрия и 2,9 г TRIS и устанавливают его величину рН до 7,5. После хорошего перемешивания 2,5 мл полученного таким путем раствора смешивают с
100 мл пробы (сыворотка). Реакцию наблюдают при 578 нм рт.ст. по фото20 !
1604167 метру, производят оценку, как указано в примере 22.
Тестоспецифические параметры (ср. пример 23 и табл.l)-. величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 мЕ/мин; коэффициент корреляции 0,988, Пример 30. 4-Метилрезоруфин.
Получают из 7,5 г 2-метил-4-нитрозорезорцина, 4,2 r резорцина, 3,6 r пиролюзита, 4,3 мл серной кислоты, 75 мл метанола, 4 г цинкового порошка и 18 мл 25Х-ного аммиака.
ДС: R = 0,70 (этанол — ацетон
2:1).
UY/YIS (0,1 М буферный раствор фосфата калия, рН 8,5), Ф „„ „ =:
= 579 нм.
2-Метил-нитрозорезорцин получают. по немецкому патенту 23 11 574, AI.
Пример 31, Сложный (4-метилумбиллифериловый) эфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты, а). 2,75 r (5 ммоль) 7а и 1 г (5 ммоль) 4-метилумбеллиферона растворяют в 30 мл тетрагидрофурана и затем добавляют 2 r (10 ммоль) дицнклогексилкарбодиимида и 0,15 г диметиламино-пиридина. После 24-часового перемешивания при комнатной температуре фильтруют и сгущают. Сырой продукт очищают Flash-хроматографией °
ДС: R = 0,40 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:3).
Ь). Эмульсию получают, как указано в примере 22, но вместо использованного там субстрата липазы применяют
35 мг сложного (4-метилумбеллиферилового) эфира 1,2-дилаурил-рац-глицеро3-глутаровой кислоты, растворенного в 1,7 мл п-пропанола. Реакцию наблюдают по флуорометру при 25 С, а именно при длине волны о возбуждения 364 нм, ширине щели
5 нм и длине волны излучения 448 нм и ширине щели 10 нм, Тест-специфические параметры (ср. пример 23 и табл.1): величина холостого опыта 0,4 мЕ/мин; чувствительность липазы 28 мЕ/мин на 100 единиц/л; коэффициент корреляции 0,9942.
Пример 32. Сложный (р-нитротиофениловый) эфир 1,2-0-дилаурил-рацглицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение 32 а-Ь аналогично примерам 7а-Ь.
1О
40 с). Получение аналогично lс из
1,4 r (10 ммоль) р-нитротиофенола, 100 мл диметилформамида, 2,4 мл пиридина, О, 2 г диметиламинопиридина и 32Ь.
ДС: R< = 0,76 (уксусный эфир— гексан I:4).
d). В 27 мл дистиллированной воды растворяют при хорошем перемешивании следующие соединения: 4,83 мг деоксихолата натрия; 28,00 мг CHES-2(циклогексиламино)-этан-сульфокислота, 17,50 г мочевины, 2,13 мг хлористого натрия, 0,16 мг колипазы свиньи, О, 33 мг хлористого кальция, 152, 00 мг тауродезоксихолата натрия. рН раствора 8,3. В этот раствор при хорошем перемешивании впрыскивают раствор сложного (р-нитротиофенилового) эфира 1, 2-О-дилаурил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты. Затем раствор обрабатывали при охлаждении
2 мин ультразвуком (средней интенсивности).
В 1 мл полученного таким путем эмульсионного раствора добавляли
50 мл пробы (содержащей липазу человеческой сыворотки) и смешивали. Реакцию наблюдали при 405 нм рт.ст. по фотометру и проводили вычисление, как указано в примере 22.
Тестоспецифические параметры: величина холостого опыта 0,3 мЕ/мин; чувствительность липазы 12,2 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции
0,998.
Пример 33. а). Сложный моноэфир 1-О-(2-метокси-октадецил)-2-0- метил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Получение аналогично примеру la из
3 r (7,7 ммоль) 1-О-(2-метокси-октадецил)-2-0-метил-глицерина, 25 мл хлороформа, 1,8 мл пиридина, О,1 г диметиламинопиридина и 1,75 (15 ммоль) ангидрида глутаровой кислоты. Выход
1,5 г (39i).
ДС: R< = 0,68 (RP18, ацетон— этанол 1:2).
Сложный (6-метилрезоруфиновый) эфир 1-О-(2-метокси-октадецил)-2-ометил-рац-глицеро-3-глутаровой кислоты.
Ь). Получение аналогично примеру
Ib из 1,5 r (3 ммоль) 33а и 1,5 мл хлористого оксалила. с). Получение аналогично примеру
2с из 0,68 r (3 ммоль) 4-метилре21 l 60416 зоруфина, 0,45 мл 1,8-диазабицикло- - (5,4,0)-ундец-7-ена и 33b
ДС: R< = 0,86 (уксусный эфир).
d). Тест-эмульсию получают, как указано в примере 22, однако в качестве субстрата липазы используют сложный (6-метил-резоруфиновый ) эфир 1-0(2-метокси-октадецил)-2-0-метил-рацглицеро-3-глутаровой кислоты. 10
Определение концентрации липазы производят через калибровочную прямую из двух стандартов различной концентрации липазы, при которой изменение экстинкции за 1 мин наносят 15 относительно изменения экстинкции.
Величина холостого опыта 8,4 ME/мин, чувствительность эстеразы 25,3 мЕ/мин,: чувствительность липазы 19,0 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции
0,9483.
Пример 34. а). Сложный моноэфир 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-3янтарной кислоты. 25
Получение аналогично примеру la из 8,56 r (20 ммоль) 1,2-0-дилаурилглицерина, 4 г (40 ммоль) ангидрида янтарной кислоты, 60 мл хлороформа, 4,6 мл пиридина и 0,24 г диметилами- 30 нопиридина. Продукт кристаллизуют из гексана. Т.пл. 41-43 С.
ДС: R1 = 0,26 (уксусный эфир— гексан 1:4).
Сложный резоруфиновый эфиР 1,2-0- 35 дилаурил-рац-глицеро-3-янтарной кислоты, Ъ). Получение аналогично примеру
17 из 2,65 г (5 ммоль) 34а, 1,06 г (5 ммоль) резоруфина, 6,18 г (30 ммоль)ц дициклогексилкарбодиимида, 0,1 r диметиламинопиридина и 50 мл диметилформамида.
ДС: Rl = 0,47 (уксусный эфир— петролейный эфир 1:3).
45 . с). Получают эмульсию как указано в примере 22, однако в качестве субстрата липазы в этом случае применяют 70 мг сложного резоруфинового эфира 1,2-0-дилаурил-рац-глицеро-350 янтарной кислоты, растворенного в
1,7 мл п-пропанола.
При этом получают следующие тестспецифические параметры (ср.пример 23 и табл.1): величина холостого опыта
3,8-4,0 мЕ/мин; чувствительность эс55 теразы не определена; чувствительность липазы 8,7 мЕ/мин на 100 ед/л; коэффициент корреляции 0,8793, 7 22
Пример 35. а). Сложный моноэфир 2 0-лаурил-октадекандиол (1,2)-1глутаровой кислоты, Получение аналогично примеру lа из 4,6 r (10 ммоль) 2-0-лаурил-октадекандиола (1,2), 29 мл хлороформа, 2,3 мл пиридина, 0,12 г диметиламинопиридина, 2,3 г (20 ммоль) ангидрида глу