Способ получения стрептавидина

Способ получения стрептавидина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к способу получения стрептавидина, который используется для выявления биотинированных ДНК-зондов в диагностике инфекционных заболеваний и иммуноферментном анализе. Для упрощения способа STREPTOMYCES AVIDINII выращивают на питательной среде, содержащей пептон, NACL и декстрозу, осаждают белки сульфатом аммония, а очистку целевого продукта осуществляют гельхроматографией на сефадексах типа G. При этом фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале относительно объемов элюции с 1,4 до 1,9 в случае использования сефадекса G - 100, 1,2-1,7 для сефадекса G - 75, 1,7-2,3 для сефадекса G - 150. Выход стрептавидина составляет 30-40 мг на 1 л культуральной жидкости. Препарат гомогенен, не содержит примесей нуклеаз и пригоден для генноинженерных работ. 1 з.п.ф-лы, 1 ил. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (2 1) 4620234/30-13 (22) 14.12.88 (46) 07. 11.90. Бюл. Ф 4 1 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С.Н.Загребельный, Л.А.Живоглядова, Т.Н.Орлова, В.К.Старостина, А.В.Селина и Г.Д.Серов (53) 615. 779. 993 (088. 8) (56) Proc, Nat. Acad. Sciences, 1980, 77, М- 8, 4666-4668.

Journal Biochemical and Biophysical methods, 1986, 13, 103-112. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТАВИДИНА (57) Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к способу получения стрептавидина, который используется для выявления биотиниИзобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способу получения стрептавидина, который используется для выявления биотинилированных ДНК-зондов в диагностике инфекционных заболеваний и в иммуноферментном анализе.

Цель изобретения — упрощение способа получения стрептавидина.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа являются: выращивание исходной культуры

Streptomyces avidinii на питательной среде, содержащей в качестве источника аминного азота пептон, что поз(51)5 С 12 P 1/06//(C 12 P 1/06, С 12 R 1:465) 2 рованных ДНК-зондов в диагностике инфекционных заболеваний и иммуноферментном анализе. Для упрощения способа Streptomyces avidinii выращивают на питательной среде, содержащей пептон, NaC1 и декстрозу, осаждают белки сульфатом аммония, а очистку целевого продукта осуществляют гельхроматографией на сефадексах типа G. При этом фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале относительно объемов элюции с 1,4 до

1,9 в случае использования сефадекса

G — 100, 1,2-1,7 для сефадекса G — 75, 1,7-2,3 для сефадекса С вЂ” 150, Выход стрептавидина составляет 30-40 мг на 1 л культуральной жидкости. Препарат гомогенен не содержит примесей нуклеаз и пригоден для генноинженерных работ. 1 з.п. ф-лы, 1 ил. 1 табл. воляет упростить используемую питательную среду, сократить длительность выращивания с 5-7 до 3 сут и обеспечить получение гомогенного целевого продута; очистка целевого продукта гель-хроматографией на гель-фильтрующих сорбентах типа О, что позволяет упростить известный способ за счет исключения стадии очистки стрептавидина на аффинном сорбенте, получение которого трудоемко, многостадийно.

Использование гель-фильтрующих сорбентов для очистки стрептавидина не требует многократного повторения

1604861 сорбции стрептавидина из одной порции культуральной жидкости.

Очистку .целевого продукта осуществ-, ляют преимущественно на сефацексах

G-75, 100, 150, причем фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале относительных объемов элюции: 1,2-1,7 в случае использования сефадекса G-75; 1,4-1,9 для сефадекса G-100, 1,7-2,3 для сефадекса

С-150.

П р и.м е р 1. Культуру Strepto. myces avidinii выращивают на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пептон 10, NaC1 5, декстроза 10, рН 7,2 в течение 72 ч, центрифугируют 30 мин при 5000 об/мин.

К 1 л супернатанта добавляют твердый сульфат аммония до степени насыщения 0,7, Осадок отделяют центрифугировани" ем при 5000 об/мин в течение 1 ч и растворяют его в 50 мл воды. Раствор бсветляют центрифугированием при 25

3000 об/мин и в течение 5 мин и супернатант наносят на колонку объемом

850 мл с сефадексом G-100, уравновешенным 0,002 M аммоний карбонатным буфером рН 8,9. Фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале

° ° тносительных объемов элюции 1,401,90. Выход получают продукта составляет 40 мг/л культуральной жидкости, Препарат гомогенен не содержит примесей нуклеаз,. пригоден для генноинженерных работ.

Пример 2. Препарат получают аналогично примеру 1, но гель-хроматографическую очистку осуществляют

40 на сефадексе G-75; Фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале относительных объемов элюции:

1,2-1,7. Выход целевого продукта составляет 38 мг/л культуральной жид45 кости. Препарат гомогенен не содержит примесей нуклеаз, пригоден для генноинженерных работ.

Пример 3. Препарат получают аналогично примеру 1, но гель-хроматографическую очистку осуществляют на сефадексе С-150. Фракции, содержащие стрептавидин, собирают в интервале относительных объемов элюции:

1,7-2,3. Выход целевого продукта составляет 40 мг/л культуральной жид- 55 кости. Препарат гомогенен, не содержит примесей нуклеаз,пригоден для генноинженерных работ.

Зависимость степени очистки целевого продукта от типа используемого сорбента представлена в таблице.

Из таблицы видно, что наибольшую степень очистки стрептавидина обеспечивают гель-фильтрационные сорбенты

G-75, G-1О0, С-150. При использовании гель-фильтрационных сорбентов другого типа, например P или Т, скорость тока и степень очистки снижаются. Сбор фракций, содержащих стрептавидин, осуществляют в экспериментально подобранных оптимальных интервалах относительных объемов элюции, что позволяет исключить потерю целевого продукта, повысить его качество, так как максимально исключается возможность попадания в целевую фракцию низко- и высокомолекулярных примесей.

На чертеже представлена гель-хроматограмма стрептавидина на сефадексе С-100.

Гель-хроматографию проводили

0,002 M и аммонийкарбонатным буфером рН 8,9. Объем колонки 850 мл, свободный объем 230 мл, объем фракций 10 мл.

По оси абсцисс отложен относительный объем элюции,кривая 1 — А кривая 2 — биотиносвязывающая активность стрептавидина. Пунктиром обозначены границы целевой фракции.

Из чертежа видно, что дальнейшее расширение границы сбора целевой фракции приводит к увеличению примесей в целевом продукте.

Таким образом, предлагаемый способ имеет следующие преимущества: использование очень простой среды, содержащей в качестве источника аминного азота пептон, позволяет получить гомогенный целевой продукт с выходом

30-40 мг/л культуральной жидкости, гель-хроматография на гель-.хроматографических сорбентах типа С позволяет эффективно разделить смесь белков и выделить гомогенный целевой продукт, что, в свою очередь, позволяет исключить из процесса хроматографическую очистку на аффинном сорбенте, получение которого трудоемко. Кроме того, качество полученного предлагаемым способом стрептавидина позволяет использовать его для тонких генноинженерных работ.

Тип сорбента P-100 P-150 С-75

Tovopear1

Т-60

G-100 G-150

Скорость тока, мл/ч.

Степень очистки

Относительный, объем элюции

14,3 30,0

12 13

73,0

48,0

30,0 t0

57,0

1,1-1 5 1,2-1 6

1, 2-1, 7 1, 4-1, 9 1, 7-2, 3 2,0-2, 5

WOO

QO0

800

600

0.4

ФОО

У20 З,Щ g.óô

Х.ФЗ l,Ю 1бК l% 8,17 2Ж

Относительньй объем эльции

Составитель О.Скородумова

Техред .Л.Олийнык КоРРектоР И.Эрдейи

Редактор А.Шандор

Заказ 3435 Тираж 482 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно †издательск комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,101

5 1604861 6

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я используют пептон, очистку осуществ- ляют гель-хроматографией на сефадек.

1. Способ получения стрептавидина, сах типа "" включающий выращивание Streptomyces, 2. Способ по п. t, о т л и ч а юavidinii на жидкой питательной среде, шийся тем, что при гель-хрома5 содержащей источник BMHHHoro азота, тографии используют сефадексы G-75

NaCl, декстрозу, и последующую хро- или G-100, или G-150, при этом фракматографическую очистку целевого про- ции, содержащие стрептавидин, собидукта, отличающийся тем, 10 рают в интервалах относительно объечто, с целью упрощения способа, в мов элюции соответственно 1,2-1,7 качестве источника аминного азота или 1, 4-1, 9 или 1, 7-2, 3 .