Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами

Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами. Способ осуществляется добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 10<SP POS="POST">2</SP>-10<SP POS="POST">8</SP> Ед/мл альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл.

QQIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (S1)S А 61 К 37/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3571944/28-14 (22) 05.04.83 (31) 57-129560 (32) 27.07.82 (33) JP (46) 07.11.90, Вюл, Р 41 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики и Дайниппон фармасьютикал Ко., Лтд (1Р) (72) Хайими Сакамото, Такао Кийота и Хироси Хаяаси (ЗР) (53) 6 12,0 15(088.8) Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы кролика, индуцированного липополисахаридами.

Получение высокоочищенного фактора некроза опухоли.

Самкам кроликов, каждая из которых имеет массу от 2 до 3 кг, внутривенно вводили 75 мл клеток Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum, Nellcome Research Labr England), убитых формалином. Спустя 8 дней каждому из кроликов внутривенно вводили 100 мг эндотоксина (липополисахарид, полученный из E.coli 0,26:Вб)

От каждого кролика получали кровь пункцией сердца через 2 ч после иньекции эндотоксина и полученную таким образом кровь смешивали с неболыпим количеством гепарина. Эту кровь подSU, 16059И АЗ

2 (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ВЫСОКООЧИШЕННОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ИЗ

ПЛАЗК ИЛИ СЫВОРОТКИ КРОЛИКА, ИНДУЦИРОВАННОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ (57) Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочишенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, инцуцированного липополисахаридами. Способ осуществляется добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 10 -10б ед/мл альбумича человеческой сыворотки в количестве 10 мкг — 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл. вергали центрифугированию в течение

15 мин нри скорости 3000 об/мин, В результате получена плазма, со ержащая некротический фактор опухоли, имеющий активность, равную 2500 ед/мл.

Полученную таким образом плазму или сыворотку (10 л), содержащую некротический фактор опухоли, разбавляли 5 л 0,03 М фосфатного буферного . раствора, рН 7,8. Разбавленную плазму вносили в колонку размером

10>42 см с DEAE-сефарозой CL-6В, Pharmacia Fine Chemicals АВ, Sweden, уравновешенную О,ОЗМ Ьос@атным буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,13 М хлористого натрия. Эту колонку промывали 2,5 л О,ОЗМ фосфатного буфер..ного раствора рН 7,8, содержащего

О, 13 М хлористого натрия, и сорбированный некротический фактор опухоли разбавляют раствором хлорида нат1б05914

Полученный таким образом раствор некротического фактора опухоли ппд— вергали повторному рехроматографированию на той же самой колонке

Sepharose S-200 с использованием того же самого буферного раствора и в результате был получен раствор некротического фактора некроза опухоли имеющий характерную активность, 9

6 равную 1, О 10 ед/мг белка, 55 рия при линейном изменении его концентрации в количестве. от 5 л 0,,03 М фосфатного GyAepa, рН 7,8; сопержащего 0,15 М хлористого натрия, до

5,0 л 0,03 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,8, содержащего 0,03 М хлорида натрия, Фракции, обладающие активностью фактора некроза опухоли, сливали вместе, подвергали ди- 10 ализу в течение 12 ч с применением

0,03 М трис-НС1буфера, рН содержащего 0,13 M хлористого натрия.

Диализованный раствор некротического фактора опухоли подвергали 15 повторному хроматогpa(bH"ованию на колонке типа DFAE-Sepharose CL-бБ (размером 3 .30 см). уравновешенную

0,03 М трис-НС1 буфером, рН 7,2, содержащим О, 15 N хлорида натрия.

Адсорбированный некротический фактор опухоли подвергали элюированию при линейном изменении концентрации хлорида натрия, раствором, содержащим 500 мл уравновешиваюшего 25 буферного раствора, и 500 мл 0,03 М трис-НС1 буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,3 М хлорида натрия.

Полученный концентрат подвергали гель-фильтрации через колонку типа

БерЬ, rose S-200, размером 5Х100 см, фирмы "Pharmacia", уравновешенную с помощью 5 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащим О, 15 М хлорида натрия. Элюирование осущест)5 вляли с помощью буферного уравновешива дщего раствора. Скорость подачи составила 80 мл/ч. Фракции с активностью некротического фактора опухоли сливали вместе и годвергали концентрированию посредством ультрафильтрации.

Полученный таким образом некроти— ческий фактор некроза опухоли характеризовался характерной активностью, равной 5,0 10 ед/мг белка и имел чистоту в 10000 раз более высокую, чем чистота плaçìû.

Пример 1. Некротический фактор некроза опухоли кроликов, обладающий характерной активностью, равной 5,0 10 6 ед/мл, полученный как указано выше, разбавляли 0,1 N фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим 0,(5 М хлорида натрия с получением в результате раствора некротического фактора опухоли с активностью 1200 ед/мл. К этому раствору некротического фактора опухоли добавляли альбумин человеческой сыворотки (USA) в количестве 0,1 мг/мл и 1,0 мг/мл USA— фракция альбумина человеческой сыворотки (СоЬы; фракция V), фирмы Sipmc

Сепг Compary.

Для каждого из полувоенных в результате растворов производилось определение остаточной активности по отношению к: образцам, соответственно подвергнутым хранению в течение о

2, 7 и 30 дней при 4 С, образцам, подвергнутым 1-му и 3-м циклам зао мораживания при -70 С и оттаиванию, образпам, подвергнутым замораживанию при -70 С, лиофилизации и хранению в течение 7 дней при 25 С. При проведении таких испытаний раствор некротического фактора опухоли, к которому не добавляли стабилизирующий агент, использовали как контрольный раствор. Что касается лиофилизованной композиции, то эту композицию подвергали растворению в стерильной дистиллированной воде и затем подвергали анализу для определения активности по некротическому фактору опухоли.

Остаточную активность определяли

in vitro u in vivo

In vivo активность фактора некроза опухоли определяли измерением цитотоксической активности против L-М клеток: в качестве емкостей для культур использовали 96-ячеечные микротитровальные пластины, клетки выращивали в минимальной среде Игла, содержащей прогретую фетальную сыворотку теленка. Образец некротического фактора опухоли объемом О, 1 мл последовательно разбавляли средой и

L-M суспензию клеток (О, 1 мл, 1<40 клеток) перемешивали в каждой из ячеек пластинок, пластинки выдерживали при 37 С в течение 48 ч в атмосфере с содержанием 57. двуокиси углерода. В конце периода выращива5 1605 .1 ния добавляли 207.-ный водный раствор глутарового альдегида (20 мл) для фиксации клеток. После фиксации пластины промывали дистиллированной водой, 5 высушивали и затем окрашивали клетки

0,057-ным красителем "11етилен голубой". Пластины тщательно промывали дистиллированной водой для удаления избыточного количества красителя и высушивали, Затем в каждую ячейку добавляли 0,2 мл 37-ной соляной кислоты для вымывания красителя из окрашенных клеток. Поглощение каждой ячейки измеряли при длине вол- 15 ны 665 нм с помощью прибора Titertek

Nactiobon фирмы Flow Laboratories

Inc. Поглощение является пропорциональным количеству видимых клеток

Активность некротического фактора опухоли, выраженная B единицах на миллиметр, измеряли, как обратную величину разведения некротического фактора опухоли, которая вызывает

50Х-ную цитотоксичность и которую

25 можно выразить графически между разбавлением и поглощением. In vitro остаточную активность определяли в процечтах и рассчитывали по экспериментальным данным и в соответствии 30 со следующим уравнением:

Формула изобретения

Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из

А

Остаточная активность = — х/од

В

У где A — активность по некротическому фактору опухоли образца после хранения или физической обработки,  — активность образца по некротическому фактору опухоли перед хранением или физической обработкой.

В соответствии с методом in vivo каждый образец раствора подвергали концентрированию с получением концентраций, которые в 20 раз выше, чем первоначальные.

Далее 0,5 мл каждого из полученных таким образом конпентрированных растворов некротического фактора опухоли вводили инъекцией в хвостовую вену, каждой из мышей с опухолью, разбитых на группы по 5 мышей. Лктивность некротического фактора опухоли анализировали спустя 24 ч в соответствии с критериями, укаэанными в табл, 1, где (-) — нет изменений (+)— незначительный геморагический некроз, 14 6 (2++) — умеренный геморагический некроз (центральный некроз, охватывающий примерно 507 поверхности опухоли); (+++) — эначительнья геморагический некроз (массовый некроэ), Пример 2. Пекротическнй фактор опухоли, имеющий характерную акти;..ность, равную 1,0<10 ????>10, 1 10, 1i106, 1 >10 и

1x?С ед/мл. К элпквотным долям кажQ доге пз приготовленных таким образом раство".ов прсизводилось добавление

УЕЛ в таком количестве, чтобы обеспечить получение в результате раствора, имеющего концентрацию, равную

1,0 мг/мл. Каждый из полученных таким образом растворов некротического фактора опухоли подвергали хранению в ь те :ение 7 дней при 4 С и затем производился анализ этих растворов на aK— тивность некротического фактора опухоли в соответствии с методом in vitro.

Остаточная ж,тивность по некроти- - ческому фактору опухоли била рассчитана по той же методике, что и в примере 1. В качестве контрольной была взята другая аликвотная доля каждого из растворов некроти ".еского фактора опухоли, в который не вводили ЦБЛ, и эти контрольные аликвотные доли также подвергали анализу на определение активности некротического фактора.

Полученные результаты представлены в табл. 2.Стабилизирующий эффеь-т различных концентраций USA при концентрации факz тора некроза опухоли 1,2 10 ед/мл представлен в табл.3.

Из результатов табл.3 следует, что стабилизирующий эффект на активность- фактора некроза опухоли выявлен в концентрации от 10 до

50000 мкг/мл раствора фактора.

1605914 центрации 10 -10 ед/мл, альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг — 50 мг на 1 мл водного плаамы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами, путем добавления к водному раствору, содержащему уклаанньп фактор в кон«6» а раствора.

Таблица

Хранение при 25 С (лиофилинированная компоэицин) Хранение при 4 С (раствор) ьный пенеиием или кой обработЗамораживание, оттаивание

ja vitro, дни п viva, дни

in vitro, дни з

in vitro, 1п чача, 1п vivo дни дни

2 7 30

52 26 4 +3 -2 30 8

40 +4

100 +++4, ++1

102 95 80 +++3 ++2 90 82

100 98 92 +++4 +1 100 94

95 +++3 ++2

«102 +++4 ++1

100 +++4, ++ )

100 +++4, ++1

1,0

Таблица 2

Остаточная активность по некротическому фактору опухоли,X, при концентрации USA мг/мл

Концентрация некротического фактора опухоли, ед/мл

0 (контрольный) 1,0

Таблица 3

Концентрация

Б$Л, мкг/мл

Остаточная активность некротического фактора опухоли, хранение при о

4 С в течение 7 дней

Контроль (без стабилиаации)

Концентрации USA мг/ил:

0,1

1«10

1 к10

1 «10

1 «10

1 «1О

1 «10

1 «10

1

5

50000

5

48 б5

79

92

98

97

98

101

99

98

110