Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля

Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам выделения и фракционирования нуклеиновых кислот. Цель изобретения - повышение выхода и упрощение способа элюирования нуклеиновых кислот из гелей. Отличительной чертой предлагаемого способа является формирование слоя геля желатины концентраций 5-10% параллельно краю разделяющего геля (полиакрилламид, агароза), причем между гелями оставляют зазор, заполненный буфером, затем осаждают нуклеиновые кислоты на геле желатины, прикладывая к комбинированному гелю электрическое поле, в направлении, перпендикулярном разделяющему. После этого с поверхности геля желатины срезают слой толщиной около 1 мм, вырезают зоны, соответствующие нуклеиновым кислотам, и расплавляют их при 37-38°С. Нуклеиновые кислоты отделяют от желатины экстракцией фенолом. Выход РНК и фрагментов ДНК, размеры которых ограничиваются возможностями разделяющего геля, составляет более 95%. Предлагаемый метод может найти широкое применение в важнейшем направлении биотехнологии - генной инженерии и различных областях молекулярной биологии, связанных с выделением нуклеиновых кислот и их фрагментов.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (III (gI)g С 07 Н 21/00

ГОСУД АРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬ1ТИЯД

ПРИ ГННТ СССР (21) 4470329/30-13 (22) 04.08.88 (46) 15.11.90. Бюл. У 42 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) М. И. Болезнин, О. Н. Болезнина и В. В. Смолянинов (53) 547.963.3(088.8) (56) Anal. Biochemistry, 1979, V. 98, р. 305. (54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВь1Х

КИСЛОТ ИЗ ГЕЛЯ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам вьделения и фракционирования нуклеиновых кислот. Цель изобретения — повышение выхода и упрощение способа элюирования нуклеиновых кислот из гелей. Отличительной чертой предлагаемого способа является формирование слоя rеля желатины концентраций 5-10% параллельно краю

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к способам вьделения и фракционирования нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является увеличение выхода и упрощение способа.

По окончании разделяющего электрофореэа перпендикулярно направлению электрического поля, параллельно краи разделяющего геля формируют слой геля желатины (5-10%) с зазором между ними

1-1,5 мм, .заполняемым буфером. Вслед за этим к комбинированному гелю прикладывают электрическое поле того же

1606511 А 1

2 разделяющего геля (полиакриламид, агароза), причем между гелями оставляют зазор, заполненный буфером, saтем осаждают нуклеиновые кислоты на геле желатины, прикладывая к комбинированному гелю электрическое поле, в направлении, перпендикулярном разделяющему. После этого с поверхности геля желатины срезают слой толщиной около 1 мм, вырезают зоны, соответствующие нуклеиновым кислотам, и расплавляют их при 37-38 С. Нуклеиновые кислоты отделяют от желатины экстракцией фенолом. Выход РНК и фрагментов

ДНК, размеры которых ограничиваются возможностями разделяющего геля, составляет более 95%. Предлагаемый ме- Е тод может найти широкое применение в важнейшем направлении биотехнологии— генной инженерии и различных областях С „ молекулярной биологии, связанных с выделением нуклеиновых кислот и их фраг— ментов. направления, что и при разделении, и © 1 поддерживают его до выхода нуклеиновых Яд кислот из разделяющего геля. Свойства геля желатины (малые размеры пор) определяют неспособность молекул нуклеиновых кислот проникать внутрь геля, след- ствием чего является осаждение молекул

ДНК и РНК на внешней по отношению к разделяющему гелю поверхности геля Ъ желатины. Далее слой желатины (0,81,2 мм толщиной) срезают, выч еняют конкретные зсны и расплавляют при 3738 С. Нуклеиновые кислоты отделяют от

Ъ желатины экстракцией фенолом.

1606511

Формула и з о б р е т е н и я

Составитель Н. Александрушкина

Редактор Т. Лазоренко Техред N.Xaäàíé÷ Корректор С. Черни

Заказ 3527 Тираж 298 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,!01

Предложенный способ обеспечивает

95Х элюцию молекул и фрагментов РНК и

ДНК разного молекулярного веса, в том числе и высокомолекулярных.

П р и"м е р 1. В горизонтальном приборе для электрофореза параллельно краю 0,8 -ного геля агарозы размерами 60х10хЗ мм, содержащего зону ДНК плазмиды pBR 322 (10 мкг), формируют 10 слой 5 -ного геля желатины размерами

60х10хЗ мм с зазором между ними 1 мм.

Зазор заполняют электрофорезным буфером. К комбинированному гелю прилагают электрическое поле напряжением

10 В в течение 2 ч. После этого с поверхности геля желатины, обращенной к агарозному гелю, срезают слой 60 х х 3 мм и толщиной около 1 мм. Фрагмент геля, содержащий плазмидную ДНК, 20 помещают в центрифужную пробирку, расппавляют при 37 С в течение 5 мин и перемешивают с равным объемом фенола, насыщенного буфером. После разделения фаз центрифугированием водную фазу 25 отбирают. После удаления следов фенола измеряют выход ДНК. Он составил более 95Х.

H p и м е р 2. Отличается от примера 1 тем, что из 0,7 -ного геля ага-30 розы (50х20хЗ) указанным способом проводят элюцию BglII-фрагмента (17,4 т.п.н.) ДНК фага Т4. Злюирующий электрофорез проводят при 10 В в течение 8 ч. Выход фрагмента ДНК более

95 .

Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1, но из комбинированного 2Х-ного полиакриламида — 0,5 ного агарозного геля (100х10хЗ) проводят элюцию РНК фага на поверхность

10Х-ного геля желатины (60x10x3). Режим элюирующего электрофореза — 20 В, 4 ч. Выход PHK более 95Х.

Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что из 10Х-ного полиакриламидного геля (50х20хЗ) элюируют указанным способом t.з Р) 58 PHK Е. coli на поверхность 5Х-ного геля желатины (%0х20хЗ). Режим электрофореза — 20 В, 6 ч, Выход 5S РНК, более 5Х.

Таким образом, предлагаемый способ дозволяет добиться гочти полного ,(95X) выхода нуклеиновых кислот разного молекулярного веса из разделяющего и элюирующего гелей, дает возможность отказаться от дорогостоящей легкоплавкой.агарозы, обеспечивает стабильность нуклеиновых кислот, способных денатурировать в интервале температур 38-65 С, позволяет концентрировать нуклеотидный материал на поверхности желатины и исключает его разбавление при экстракции фЪнолом, обеспечивает возможность элюции из различных типов гелей и, наконец, получаемые элюаты не содержат примесей, ингибирующих разного рода ферйентативные активности, в том числе зндонуклеазные.

Все это позволяет широко использовать описанный подход в генной инженерии и различных молекулярно-биопогических исследований, связанных с разделением и получением нуклеиновых кислот и их фрагментов.

Способ извлечения нуклеиновых кислот из геля,,предусматривающий проведение электрофореза, расплавление геля, экстракцию фенолом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения способа, перед электрофорезом, параллельно ,краю разделяющего геля и перпендикулярно силовым линиям электрическог о поля, формируют слой геля желатины концентрацией 5 — 10Х, причем месяцу гелями оставляют зазор, заполненный буфером, а расплавляют слой геля желатины, обращенный к агарозному гелю.