1607689 - Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)

Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена. Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств. Способ активации тканевого активатора плазминогена - T PA, полученного в результате экспрессии гена T PA в клетках ESCHERICHIA COLI и PSEUDOMONAS PUTIDA, предусматривает проведение реакции реактивации при PH 9 - 11, концентрации G SSG 0,05 - 3 ммоль/л и концентрации G SH 0,1 - 20 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,05 - 1 моль/л или мочевины в концентрации 1 - 4 моль/л, или метилмочевины в концентрации 0,5 - 3 моль/л, или демитилмочевины в концентрации 0,5 - 1 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0,25 - 0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5 - 5 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5 - 4 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,5 - 1 моль/л. 2 с. и 5 з.п. ф-лы, 24 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

Мй

РЕСПУБЛИН

30ЫОВММ

@,щук тцр цр ущип

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТЫ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4202987/30-13, (86) РСТ/ЕР 86/00610 (23.10.86) (22) 22.06.87 (31) P 3537708.9 (32) 23,10.85 (33) DE (46) 15.11.90. Бюл. В 42 (71) Берингер Маннхайм 1йбХ (DE) (72) Райнер Рудольф, Штефан Фишер и Ральф Маттес (DK). (53) 575.224.2(088.8) (56) EP И 0114506,кл. С 12 Н 15/00, 1984. (54) СПОСОБ АКТИВАЦИИ ТКАНЕВОГО. АКТИ-.

ВАХОРА ПЛАЗМИНОГЕНА (ЕГО ВАРИАНТИ) (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена, Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта за счет более полного восстановления его нативных свойств. Способ активации ткаI

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения активного плазминогена..

Целью изобретения является улучшение качества конечного продукта sa счет более полного восстановления его нативных свойств.

Пример 1. а) Приготовление "refractile Ъоdies".

100 г влажной клеточной массы

Е. coli в 1,5 л 0,1 моль/л трис/НС1 !

SU... 16076&9. А 3 (g1)g С 12 Я 15/12, С 12 Р 21/00

2 невого активатора плазминогена вЂ” tPA, полученного в результате экспрессии гена tPA в клетках Escherichia coli и Pseudomonas putida, предусматривает проведение реакции реактивации при рН 9-11 концентрации gSSg 0 053 ммоль/л и концентрации gSH 0,120 ммоль/л. В качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентрации 0,05l моль/л или мочевины в концентрации

1-4 моль /л, или метилмочевины в концентрации 0 5-3 моль/л, или диметилмочевины в концентрации 0,51 моль/л, или этилмочевины в концентрации 0,25-0,75 моль/л, или формамида в концентрации 0,5-5 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,55 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4 моль/л или бутирамида в концентрации 0,5-1 моль/л. 2 с.и 5 з,п. ф-лы, 10 табл.

1 и 20 ммоль/л ЕДТА гомогенизируют (Ultra-Turrax 1 0 с) и добавляют

0,25 мг/мл лиозима. После 30 мин инкубации при комнатной температуре вновь гомогенизируют и охлаждают до

30С, Разложение клеток осуществляют путем дисперсии п,".и высоком давлении (550 кг/см ). Затем проводят и промывку 300 мг/л 0,1 моль/л трис/

/НС1 (рН 6,5) и 20 ммоль/л ЕДТА.

После центрифугирования (2 ч для

27000 g, 4 С) гранулы вводят в, 1607689

Выход готового продукта в пересчете на количество tPA примерно 12%.

1,3 л 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 696), 20 ммоль/л ЕДТА и 2,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют. После повторног о центрифугирования (30 мин для

27000 g, 4 С) гранулы вводят в 1 3 л

0,1 моль/л трис НС1 (рН 6)5), 20 ммоль/л ЕДТА и 0,5% тритон-Х-100 и гомогенизируют. Чередование центрифугирования (30 мин для 27000g, 4 С) и гомогенизации гранул в 1 л

0,1 моль/л трис/НС1 (рН 6,5) и

20 ммоль/л ЕДТА проводят еще трижды.

Содержание tPA "refractile bodies" определяют по SDS-PAGE ) идентификацию )5

tPA-полос по Westirn-blotting" денситометрическим анализом "Refractile bodies" по SDS-РАСЕ и"Mestirnblotting".

Анализ показывает плотную tPAполосу с мол. весом около 60 кДт.

Доля tPA в общем содержании протеина "refractile bodies" составляет около 21%. б) Растворение/восстановление

"refractile bodies"..

Белок инкубируют при концентра- ции 1-5 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида 0,15-0,4 моль/л ДТЕ и l ммоль/л

ЕДТА в течение 2-3 ч нри комнатной температуре. Затем нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.п.) отделяют центрифугированием (30 мин для 35000-50000 g 40 С).

Величину рН надосадочной жидкости устанавливают концентрированной соляной кислотой до рН 3. Денатурирующее

1 средство и восстановитель отделяют диализом против 0,01 моль/л НС1 при 4 С.

40 в) Повторное окисленне/активация.

Повторное окисление/активацию проводят 1:50 вЂ” 1:200 разбавлением

45 буфером 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммолы л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, . 0,5 моль/л 1 -аргинина, 2 ммоль/л

GSH 0,2 ммоль/л GSSG.

После 17-24 ч активации при 20 С определяют активность в сравнении

50 с активностью естественного гликолизированного tPA из эвкарнонтов.

Выход готового продукта в пересчете на общее содержание протеина

2,5 + 0,5%., стимулируемость 10+ 5.

Та блица 1

Выход)) ) % Стимулируемос (коэффициент) GSSG) ммоль /л

0,2

О,13

1,49

1,28

1,04

0,98

l ) 7 7

4,0

7,4

5,4

5,8

6,2

10,0 Выход активного tPA в пересчете на общее содержание. протеина "refractile bodies". г) Повторное окисление/активация без отделения денатурирующее средство/в осстановитель .

Белок инкубируют при концентрации

1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/HCl (рН 8,6), 6 ммоль/л гуанидингидрохлорида, 0,2 моль/л ДТЕ и 1 моль/л

ЕДТА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 1:100 разбавлением в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА) 1 мг/мл BSA) 0,3 моль/л

L-аргинина и:в указанных в табл, 1 количествах GSSG. Дополнительно в активирующей добавке находится остаточная концентрация 0,06 моль/л гуанидингндрохлорида и 2 ммоль/л ДТЕ .

Зависимость выхода активаций от

GSSG-концентрации при активации без отделения денатурирующее средство/ восстановитель показана в табл. 1.

Пример 2. Около 5 мг белка инкубируют в 1 мл 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,6), 6 моль/л гуанидингидрохлорида и 0,15-0,2 моль/л ДТЕ в течение

2-3 ч при комнатной температуре, Нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.д.) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 g)

Денатурирующее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Sephadex G. 25 в 0,01 моль/л

НС1, При этом проба разбавляется на коэффициент -10. Восстановленный материал растворяют в 0,01 моль/л

НС1 при -20 С.

5 160768

Пример 3. В табл. 2-15 пока вано влияние различных параметров на активацию и стимулируемость tPA.

Для эксперимента повторного окисления восстановленный протеин, раство5 ренный по примеру 2, больше, не очи-., щают.

Восстановленный протеин (в

0,01 моль/л HCl) активируют растворением 1:10 - 1:500 в буфере повторФ ного окисления..Активацию определяют после 22-48 ч.инкубации при комнатной температуре. Активация окисленного повторно протеина по отношению к стандартному повторному окислейию (IOOX) в О,1 моль/л трис/НС1 (рН 1 0,5) + I ммоль/л ЕДТА, 0,5моль/л

L-аргинина, 1 мг/мл BSA, 0,5 моль/л

GSH (восстановленный глютатион), 20

0,5 ммоль/л GSSG (дисульфид глютатиона) .

1. Зависимость выхода активации от добавки Ь-аргинина или гуанидингидрохлорида. 25

Повторное окисление в 0,1 моль/л,. трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл L-аргинина, 0,5 ммоль/л BSA, 0,5 ммоль/л GSSG

Зависимость выхода активации от 30 концентрации Ь-аргинина представлена в табл. 2.

Та блица 2

L-аргинин, Ак тив нос ть Стимулируемоль /л мость (коэффициент) Зависимость активации от добавки мочевины следующая:

Мочевина Ак тив ность, моль/л Ж

I 59

1,5 126

2 162

2,5 141

3 72

4 12

Зависимость активации от добавки метилмочевины:

Иетилмочевина Активность, моль/л й

0,5 22

1 174

1,5 313

2 375

2,5 332

Э 215

Зависимость активации от добавки этилмочевины:

Зтилмоч евина Ак тив нос ть, моль/л Х

212, 323

0,5

1,5

2 300

2,5 107

Зависимость активации от добавки диметилмочевины представлена в табл. 3.

Та блица 3

0,25

0,5

0,75

1,0

7,5

21,9

16,3

3 5

Актив нос ть, (X) 0,25 22

0 5 53

0,75 58

2 . .Зависимость активации от добавки мочевины и производных мочевины.

Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA, 5 ммоль/л GSH,.

0,2 ммоль/л GSSG.

Зависимость выхода активации от концентрации гуанидинхлорида следующая

Гуанидинхлорид, моль/л

Диметилмо- Активность, Стимулируечевина, Х мос ть (коэф40 моль/л фициент) 50

Э. Зависимость активности от добавки амидов жирных кислот.

Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5) 1 ммоль/л ЕДТА, 1 мг/мл BSA 5 ммоль/лGSH 0,2 ммоль/л

GSSG, Зависимость активации от добавок фо рмамида:

0 5

45 1в5

2,5

167

256

283

177

8,8

8,9

9,4

7,7

8,9

9,9

8,6. 1607689

Формамид, Активность, моль/л %

0,5 59

1 175

1,5 245

2 325

2,5 423

3 444

4 416

5 341

Зависимость активации от добавок метилформамида:

Метнлформамид, Активность, моль/л %

L-аргийийа, ) мг7мл 3 А, 0,5ммоль/л

GSH, 0,5 ммоль/л СЗБС.

Зависимость активности от величины РН представлена в табл,4, ) . а б л и ц а 4

РН Ак тив нос ть, С тимулируем ос ть

% (коэффициент) 13,6

20,3

21,3

105

5. Зависимость выхода активности от GSH/GSSG концентрации.

Повторное окисление в 0 1 ммоль/л трис/НС1 (рН 1 0,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 ммоль/л I.-аргинина, 1 мг/мл BSA. а) 1 ммоль/л СЯН.

Зависимость активности от концент25 рации GSH представлена в табл. 5.

Активность, %

Таблица 5

GSH, Ак т ив ность, Стнмулируемос ть

30 (коэффициент) 0,5

1,5

2,5

134

207

261

204

237

14,9

15,3

13,3

12,5

2,1

239

273

)93

198

0,1

0,2

0,5

4 ) 98

5 141

Зависимость активации от добавок пропионамида:

Пропионамид, Активность, моль/л % б) О, 2 ммоль/л GSSG зависимость активности от концентрации GSSG представлена в табл. 6.

Та блица 6

Активность, СтимулиРУЮ

% мость (коэффициент) С$8С, ммоль/л

Актив нос ть, %0,5 55

1 52

4. Зависимость выхода активности от величины РН.

Повторное окисление в 0,1 моль/л трис/НС1, 1 ммоль/л ЕДТА„0,5моль/л

0,5

1,5

2,5

Зав ис им ос ть ацетамида:

Ацетамид, моль/л

0,5

1,5

2,5

Зависимость бутирамида

Бутирамид, моль/л

304

389

466

452

121 активации от добавок

197

150

101

2 активации от добавок

5С О,О5

0,1

0i2

0 5

)12

142

273

143

2,2

3,8

6,8

7,4

6,8

7,9

6,3

5,) 1607689 !0

1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргинина, 1 мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH (табл. 17) .

Воспроизводимость результатов активации tPA,SSG представлена в табл. 8.

Пример 4. Активация tPA сме шанными дисульфидами ):РА и глютатиона.

Использование "refractile bodies полученных по одному из предыдущих примеров, Восстановление "refractile

bodies" проведено за 2 ч инкубации ! при комнатной температуре в 0,1 моль/л, трис/ЧС1 (pH 8,6), ) ммоль/л ЕДТА, 6 моль/л Gdn HCl, 0,2 моль/л ДТЕ при концентрации протеина около I мг/мл.

Диализированный 0,0) мл/л НС1 восстановленный протеин разбавляют в соотношении 1:1 0,1 моль/л трис/НС1, рН 9,3, 9 моль/л мочевины и0,2 моль/л

GSSG и инкубируют 5 ч .при комнатной температуре.

После подкисления концентрированной соляной кислотой до рН Э проводят диализ 0,01 моль/л НС1 при.4 С. После диализа общая концентрация протеина составляет 0,35 мг/мл. Таким образом получают tPASSG. а) рН вЂ” оптимум активации tPASSG. 25

Здесь, как и в последующих экспериментах по оптимизации условной реактивации, не применяют GSSG и активацию проводят через 17 ч путем разбавления в 0,) моль/л трис, ) ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л L-аргини" на, 1 мг/мл BSA и 1 ммоль/л GSH npu изменении величины рН (табл. 7).

Таблица 8

8,65

4,47

4,49

8,50 ,45

4,32

3,29

3,54

5,07

Средняя величина

7,0

9,3

9,7

6,5

17,2

8,3

)4,0

13,4

)6,4

5,1+ ),9

11,3+,8 в) Стабильность активированного протеина.

Активацию проводят в 1:200 разбавлении в О,l моль/л трис/НС1, 1 ммоль/л ЕДТА, 0,5 моль/л Ь-аргинина, мг/мл BSA и 2 ммоль/л GSH.

Данные о стабильности активированного протеина приведены в

35 табл. 9.

Таблица 7

Та блица 9 рН

Время

45. 71,2) 5

239

1,35

11,4

)5,5

23,1

23,6

2I 5

22,6

14,3

5,66

7,32

8,65

8,59

8,32 °

6,)5

3,07

7 1

8,2

7,0

8,7

11,7

12,5

11,2

7,5

8,5

9,5

10,5

Выход, 7 Стимулируемость

Выход готового продукта определен по проценту активности tPA в пересчете на введенное количество протеина, б) Воспроизводимость результатов активации tPASSG.

Все данные активации суммируют; после 1:)00 или 1:200 разбавления в О,) моль/л трис/НС1 (рН 8,5), Выход, Х Стимулнруемость

Выход, Х Стимулируемос ть

0,89

2,43

2,83

2,62

2,21

2,28

II р и м е р 5. Активация полученного генной технологией интерфероíà-Р.

Восстановление/рас тв оренис и ров одят следующим образом: осадок инкубируют Э ч при 25 С в 10 мл 9,1 моль/л трис/НС1 (рН 8, 6), 6 моль /л Gdn НС1, 1 имоль/л ЕДТА и 0,2 моль/л ДТЕ и . после 30 мин центрифугирования при

4ОС и 48000 g величину рН надосадоч160768

Таблица 10!

0,5 ,0 5

0 5

0,5

0,1

0,5

1,0

5 иой жидкости устанавливают концентри" рованной НС1 около 3, Затем проводят гелевую фильтрацию через Sephaclex

G25 в 0,01 моль/л НС1.

Элюат исследуют на проводимость, концентрацию протеина и реактивируем,ость, Активацию повторно окисленного протеина определяют по стандартной активации (= 100%) в 0,1 моль/л трис/НС1 (рН 10,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH) 0,5 ммоль/л GSSG u

0,25 моль/л L-аргинина, а) Зависимость выхода активации от добавки L-аргинина.

Элюат разбавлен 0,1 моль/л трис/

НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSSG и активирован 20 ч при 0 С.

Зависимость активации от L-аргинина следующая

L-аргинин, Ак тив ность, моль/л %

9 12

Элюат разбавляют 1:50 буфером

0,1 моль/л трис/НС1 (рН 8,5), 1 ммоль/л ЕДТА и 0,25 моль/л L-аргинина и пробу исследуют после 17 ч активации при 0 С.

Зависимость активации от добавки

GSH/GSSG представлена в табл. 10.

G SH/G SSG, Зав ис им ос ть. Ак тивнос ть, ммоль/л активации, % ммоль /л

Ак тив нос ть, %

Мочевина, моль/л

100

0,5

1,5

Ак тив нос ть, % рН

6,5

7,5

8,5

9,5

10,5.0

100

0,25 8

0,5 15

0,75 15 б) Зависимость выхода активации от добавки мочевины.

Раствор активации соответствовал рас тв ору п о пункту а), однак о ак тио вацию проводят 17 ч при 0 С.

Зависимость активации от добавки мочев,ины: в) Зависимость выхода активации от добавки формамида.

Активация как в пункте a); пробы исследуют после 17 ч активации при

00 С

Зависимость выхода активации от добавки формамида:

Формамиц,, Ак тив нос ть, моль/л %

О 13

1 13

2 13

3 0

4 0 г) Зависимость выхода активации от окислительно-восстановительного буфера. д) Зависимость выхода активации от добавки BSA.

Элюат разбавляют 1:50 буфером

О, 1 моль/л трис/НС1 (рН 8, 5), 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л GSH, 0,5 ммоль/л GSSG и 0,25 моль/л L-аргинина и исследуют через 17 ч активации при ООС;

Зависимость активации от добавки

В$А:

BSA мг/мл Ак тив нос ть, % е) Зави имость выхода активации от рН.

Элюат равняют 1:50 буфером

О,) моль/л трис/НС1 „ 1 ммоль/л ЕДТА, 5 ммоль/л L-аргинина и исследуют че" рез 17 ч активации при 0 С, Зависимость активации от величины рН;

1607689

Формула изобретения

Составитель Т. Забойкина

ТехРед JI.Сердюкова КоРРектоР М. ШаРоши

Редактор М. Циткина

Тираж 493

Подписное

Заказ 3556

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035,;1осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина,101

1. Способ активации тканевого активатора плазминог ена, . включающий экспрессию гена tPA в клетках Escherichia ñî1i или Pseudomonas putida, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, отделение нерастворимых составных частей, салюбилиэацию в растворе, содержащем 6 моль/л гуанидинхлорида в присутствии 0,150,2 моль/л DTE очистку с отделением денатурирующего средства и восстановителя, реактивацию в слабом денатурирующем растворе путем обработки окисленной вЂ” gSSg и восстановимойвЂ”

gSH, отличающийся тем, что стадию реактивации осуществляют при рН 9-11, при концентрации gSSg

0,05-3 ммоль/л и концентрации gSH

0,1-20,0 ммоль/л, а в качестве слабого денатурирующего раствора используют раствор L-аргинина в концентра- 25 ции 0,05-1,0 моль/л, или мочевины в концентрации 1-4 моль/л, ипи метилмочевины в концентрации 0,5-3,0 моль/и, или диметилмочевины в концентрации

0,5-1,0 моль/л, или этилмочевины в концентрации О. 25-0, 7 5 моль /л, или формамида в концентрации 0,55,0 моль/л, или этилформамида в концентрации 0,5-5,0 моль/л, или ацетамида в концентрации 0,5-4,0 моль/л, или бутирамида в концентрации 0,51,0 моль/л.

2. Способ поп. 1, о тлич а ю шийся тем, что стадия реакти- щ вации концентрации - gSH составляет

О, 2-1 О, О ммоль/л и/или концентрация

gSSHg 0,05«1,0 моль/л, 3. Способ по п. 1 или п.2, о т л ивЂ” ч а ю шийся тем, что перед реактивацией проводят дополнительную стаI дию очисTKи

4. Способ по п. 1 или п.2, о т л ивЂ” ч а ю шийся тем что реактивацию проводят в присутствии денату" рирующего средства и восстановителя, при этом реакционную смесь после процедуры денатурации - восстановителя разбавляют буфером реактивации так, ч тобы п ри последующей реактивации концентрация gSSg превосходила остаточную концентрацию

ДТЕ.

5. Способ активации тканевого активатора плазминогена, включающий экспрессию гена tPA в клетках Escherichia coli или Pseudomonas putida, включающий суспендирование и разрушение бактериальных клеток в буферном растворе, содсржащем 6 моль/л

ryaHHpHíõëoðèäà в присутствии 0,50,2 моль/л ДТЕ, очистку с отделением денатурирующего средства и восстановителя с последующей реактивацией, отличающийся тем, что после отделения гуанидинхлорида белок переносят на смешанный дисульфид инкубацией с gSSg при концентрации

0,1 моль/л в присутствии 4,5 моль/л мочевины, а реактивацию проводят при рН 7-10,5 путем обработки gSH в концентрации 1-3 ммоль/л в присутс тв ии О, 5 м оль /л Ь-а рг и нина, 6. Способпоп. 5, о тлича ю шийся тем, что стадию реак-. тивации проводят в сывороточном альбумине BSA.

7. Способ по п..1 или п. 6, отличающийся тем,что суспендирование и разрушение бактериальных клеток проводят в С,1 М трис-буферном растворе с рН 6,5.

Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)

Патент 1607689