Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли

Способ стабилизации рекомбинантного фактора некроза опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли,полученного генно-инженерным путем. Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору фактора некроза опухоли, который получают в результате культивирования штамма ESCHERICHIA COLI, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК PHTNF LAC UV 5-2 с последующим культивированием и выделением конечного продукта. 6 табл.

I»» 1»

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (gI)g С 12 N 15/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Чаl Ala His Val Val

Ala Asn Pro Gln Alа Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Agr

Ala Asn Аlа

Leu Leu Ala Asn Gly

Pro Ser Glu Gly Leu

Val Glu Leu

Arg Asp Asn Gln

Tyr Ser Gln Val

Leu Val Val

Tyr Leu lie

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr (21) 3918201/30-13 (22) 06.06.85 ф (3!) 59-115496 (32) 07.06.84 (33) JP (46) 15.11..90. Бюл. N- 42 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики Кайся (JP) (72) Хадзиму Сакамото, Такао Киета, Хиратака Итох и Хироси Хаяси (JP) (53) 3,5.224.2 (088.8) . (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ РЕКОИЬИНАНТНОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОГРХОЛИ

Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли, полученного генно-инженерным путем..

Способ стабилизации физиологическ и ак тивно го соединения в ключ ае т прибавление альбумина к водному раствору или содержащему фактор некроза опухоли (ФНО), где указанное физиологически активное соединение получено с использованием рекомбинантной ДНК кодирующей фактор некроза опухоли, обладающий цитотоксическим действием на клетки Е-11 и способный вызывать

„,Я0„„1607690 А 5

2 (57) Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к стабилизации фактора некроза опухоли, полученного генно-инженерным путем. Способ стабилизации физиологически активного соединения включает прибавление альбумина к водному раствору фактора некроза опухоли, который по— лучают в результате культивирования штамма Escherichia coli, трансформированного рекомбинантной плазмидной

ДНК рНТ I

Фактор некроза опухоли получают обычным методом рекомбинантнь|х ДНК с использованием рекомбинантной ДНК, кодирующей физиологически активное соединение. При испытании ФНО проявляет цитотоксическую активность против клеток L-N и вызывает геморрагический некроз трансплантированной мышам BALB/C саркомы NethA. ФНО характеризуется следующей последовательностью аминокислот.

l607690

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr С1п Thr Lys 1 а1 Asn

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Пе Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe

Gly Ile Ile Ala Leu ет следующую структуру:

ТСА ТСТ ТСТ CGA ACC CCG AGT GAC AAG ССТ GTA ССС САТ GTT GTA

GCA AAC ССТ САА GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG ААС CGC CGG

GCC ААТ GCC СТС CTG GCC ААТ GGC GTG GAG CTG AGA GAT ААС CAG

CTG GTG GTG ССА ТСА GAG GGC CTG ТАС СТС АТС ТАС ТСС CAG GTC

СТС ТТС AAG GGC CAA GGC TGC ССС ТСС АСС САТ GTG СТС СТС АСС

САС ACC ATC AGC ССС АТС GCC GTC ТСС ТАС CAG АСС ААС GTC AAC

CTC CTC ТСТ GCC АТС AAG АСС ССС ТСС CAG AGG GAG АСС CCA GAG

GGG GCT GAG GCC AAG ССС TGG ТАТ GAG ССС ATC ТАТ СТС GGA GGG

GTC ТТС CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA СТС AGC ССТ GAG АТС AAT

CGG ССС GAC ТАТ СТС GAC ТТТ GCC GAG TCT GGG САС GTC ТАС ТТТ

GGG АТС АТТ GCC CTG, а фрагмент ДНК, кодирующий ФНО, имеДанный полипептид получают следующим образом.

Ткань поджелудочной железы человека или кролика измельчают до вымрро1 женно ro порошка, депротекниэируют, в результате осаждения получают высокомолекулярную кроличью или челове- ческую ДНК; высокомолекулярную ДНК частично расщепляют ; фрагменты ДНК фракционируют по размерам и выделяют фрагмент размером 5000-20000 пар оснований (по); фрагменты, полученные на предыдущей стадии, клонируют с использованием вектора фага

Charon 4А; получают библиотеку ДНК человека или кролика в фаге.

1. В к-ДНК кроличьего ФНО вводят радиоактивную метку 32 по способу

55 тр ан сл я ции.

2. Каждый из геномных наборов бактериофаг 9 /кролик и бактериофаг

®человек отбирают для гибридизации с помощью 32 P-меченной к-ДНК кроличьего ФНО.

3. Из соответствующих клонов выделяют ДНК, составляют ее рестрикционную карту и анализируют гибридизацией по Sautheres.

Полученные в результате гидролиза рестриктазой фрагменты, содержащие гены кроличьего или человеческого

ФНО, субклонируют в плазмидные векторы и затем определяют в них последовательность оснований.

4. Последовательность оснований в к-ДНК кроличьего ФНО сравнивают с последовательностью оснований в гене кроличьего ФНО и определяют экзоны и интроны в гене кроличьего ФНО .

5. После этого последовательность оснований гена человеческого ФНО сравнивают с последовательностью ос1607690 нований гена кроличьего ФНО и определяют экзоны и интроны гена человеческого ФНО.

6, Подтверждают, что аминокислотная последовательность кроличьего

ФНО, рассчитанная из последовательности оснований, полученной удалением интронов гена кроличьего ФНО в комбинированном его экзонов,согласуется с аминокислотной последовательностью, рассчитанной из последовательности оснований к-ДНК кроличьего

ФНО .

7. Затем аминокислотную последовательность физиологически активного соединения, используемого в изобретении, рассчитывают из последовательности оснований ДНК, кодирующей физиологически активное соединение,полученной удалением интронов гена, кодирующеro физиологически активное соединение, и соединением его экзонов. Подтверждают, что аминокислотная последовательность физиологически активного соединения частично согласуется с аминокислотной последовательностью кроличьего <>HO °

3. Пс сле этого ДНК, кодирующую физиологически активное соединение, модифицируют по концам in vitro для введения соответствующего носителя экспрессии и получения рекомбинантной

ДНК, содержащей кодирующую ДНК, Рекомбинантную ДНК используют для трансформаций клетки-хозяина, которая, в свою очередь, может расти в культуре и эксрессировать целевое физиологически активное соединение.

9. Полученное таким образом физиологически активное соединение в своей полной форме имеет 155 аминокислотных остатков, начинающихся с серина. Если оно в своей последовательности-предшественнике имеет сигнальный пептид, то этот сигнальный пептид имеет сильно гидрофобный характер.

Полученный таким образом трансформированный организм культивируют в широких масштабах обычным способом с получением ФНО. После этого супернатант культуры или клеточный экстракт собирают и получают ФНО.

Полученный ФНО очищают с использованием либо с помощью обычных биохимических методик, с получением водного раствора ФНО, который лио5

1О фильно высушивают и получают порошок очищенного ФНО.Очистку ФНО осуществляют путем высаливания с исполь зованием сульфата аммония, ионообмен ной хроматографии с использованием анионообменной смолы, гель-фильтрации и электрофореза.

Апьбумин прибавляют к раствору в количестве приблизительно 1 мкг или больше, предпочтительно 10 мкг или больше, особенно предпочтительно

100 мкг или больше, на 1 мл раствора, имеющего цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-!!

Ф равную 10 — 10 ед./мл (единица активности будет определена ниже) . Верхний предел количества альбумина обычно определяют по его растворимости

20 и вязкости результирующего раствора.

Верхний предел количества альбумина как правило равен 50 или 10 мг на

I мл раствора ФНО. Если ФНО стабилизируют в форме порошка, то альбумин

25 прибавляют к порошку в таком количестве, чтобы водный раствор, получаемый растворением порошкообразного физиологически активного соединения . и имеющий активность 10+10 ед,/мл, 30 имел вышеуказанные концентрации альбумина.

Способ, .которым прибавляют альбумин, не играет существенной роли.

Например, альбумин в порошкообразной форме можно непосредственно прибавлять к раствору активного соединения. Кроме того, порошкообраэный альбумин для удобства может быть растворен в воде или подходящем буфе4п ре и прибавлен к раствору. Порошкое образный альбумин также может быть смешан с порошком активного соединения. Прибавление альбумина может быть осуществлено в любой момент

45 стадии очистки или стадии получения фармацевтич еских рецептур.

ДНК из тимуса теленка/SS PE:

0,18 M NaC1+10 MM NaH

ЭДТУ, рН 7,4.

СХФ вЂ” среда хранения фага, содержащая 5,3 г NaC1, 2 r MgSOq 7HqO, 50 мл 1 H трис-НС1 (рН 7,5) и 5 мл

2Z.-ного раствора желатины на 1 л.

МЕ-Бульон: среда, содержащая 10 г

NZ-амина, 5 г НаС1 и 2 r MgSO 7H O (NZ-амин представляет собой типа АЧ гидролизат казеина, производимый и поставляемый Humko Shef field Chemiсаl Durnon of Kraft, Gnc., CPIA).

1607690

ИПТГ: изопропилтиогалактозид. х-гал: 5-дибром-4-хлор-3-индолилгелактозид.

ТА3; 0,04 М Трис-ацетат (рН 8,0)

0,002 М ЭДТУ.

5 х раствор Денхард ra: водный раствор, содержащий 1000 мг Ficoll

1000 мг поливинилпирролидона и

1000 мг БСА в 1 л. п,о,: пара оснований.

Пример 1. Крольчихам массой

2,5-3 кг инъекцией в ушную вену вводят по 50 мг убитых формалином Propionebacterium acnes (Corynebacterium parvum, Wellcome Research Laboratories Англия). Через 8 дней снова через ушную вену вводят 100 мкг эндотоксина (дипополисахарид из Escherichia coli 026:В6, производство

Difco Laboratories, Сп1А, через 2 ч из сердца отбирают цельную кровь. К полученной крови прибавляют гепаринат натрия в количестве 100 ед. на

100 мл. Затем кровь центрифугируют 25 при охлаждении со скоростью 5000 об/

/мин в течение 30 мин для удаления клеток крови и нерастворимых твердых соединений, В результате из 40 кроликов получают плазму (2,4 л), имеющую 30 цитотоксическую активность сывороточного ФНО, равную Зх!О ед,/мл.

К плазме (2,4 л) прибавляют 24 r цеолита. Результируюг!ую смесь перемешивают H течение 1 ч, после чего отфильтровывают, фильтрат смешивают

35 с 1,2 л буфера 0,04 M Трис-НС1 (рН

7,8) и наносят на колонку с DEAESpharose CL-6В, тщательно уравновешенную против 0,04 M Трис-НС1 буфера 40 (рН 7,3), содержащего 0,1 М NaC1

Колонку промывают 0,04 M Tpuc-HCl буфером и адсорбированный ФНО элюируют 0,04 M Трис-НС1 буфером (рН 7,2), содержащим 0,18 M 11аС1, Фракции,проявляющие цитотоксическую активность против L-клеток, концентрируют ультрафильтрацией. Полученный таким образом концентрат наносят на колонку с Sephacryl S-200, тщательно уравно50 вешенную против 5 мМ фосфатного буфера, и подвергают гель-фильтрации с использованием этого же буфера. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией и получают очищенный

ФНО, имеющий активность 3,5xl0 ед.

6 5 и удельную активность 18х10 ед./мг, Кроличий сывороточный ФНО смешивают с полным стимулятором Фрейнда (1:1) и подкожно вводят в спину мышам-самцам Ва ЬВ/С, имеющим возраст

12 недель. Вышеуказанную операцию повторяют через 2 и 4 недели после первоначальной инъекции. Через 1 неделю после последней инъекции отбирают цельную кровь, Из отобранной крови получают сыворотку.

Полученную таким образом сыворотку прибавляют к культуральной среде для оценки цитотоксической активности ФНО против L — клеток в таком количестве, чтобы результирующая концентрация соответствовала 500-кратному разбавлению. Цитотоксическую активность кроличьего сывороточного

ФНО против L-клеток измеряют так, как описано вьнпе. Устанавливают,что кроличий сывороточный ФНО не проявляет цитотоксической активности против L-клеток. Из этого результата можно сделать вывод о том, что полученная на этой стадии мьппиная сыворотка содержит антитело к кроличьему сывороточному ФНО (далее обозначают как анти вЂ Ф ан итело) °

Крольчихам внутривенной инъекцией вводят убитые формалином клетки

Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum, Wel1come Pesearch

Laboratories, Англия), Через 7 дней кроликов подвергают трехестомии,легкие промывают физиологическим солевым раствором и получают таким образом всплывающие клетки. Полученные таким образом клетки промывают физиологическим солевым раствором. C использованием культуральной среды

RPM1 1640s содержащей 10 об.7 заро дьппевой телячьей сыворотки, клетки инкубируют при 37 С в воздухе,содержащем 57. углекислого газа. Клеточную культуру разделяют на две группы и к одной из них прибавляют эндотоксин, полученный из Е.coli (липополисахарид из Е.coli 026: В6), в концентрации 10 мкг/мл. К другой группе приб авляют такое же к оличес тво дистиллированной воды. Супернатант клеточной культуры, к которой прибавлен эндотоксин, проявляет цитотоксическую активность против Ьклеток, и активность достигает максимума в течение 7 ч. Эта .активность подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной мьппиной сывороткой .

16

Кроме того, супернатант клеточной культуры, к которой не прибавляли эндотоксин, не проявляет цитотоксичности против L-клеток.

К клеточной культуре, к которой прибавлен эндотоксин, дополнительно прибавляют радиоактивный L-/35S)-метонин (1300 кюри/ммоль, в количестве 1 милликюри/мл), Супернантант анализируют электрофорезом на полиакриламидном геле с Д".Н в соответствии со способом Laemmli. Концентрацию геля доводят до 12,5 мас.7. После электрофореза гель обрабатывают с помощью Е11НАНСЕ и после высушивания экспонируют на рентгеновскую пленку. Устанавливают, что в супернатанте клеточной культуры в присутствии эндотоксина образуется соединение, имеющее молекулярный вес около

17500.

Супернатант каждой клеточной культуры Подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле с ДСН так же, как описано выше. После этого гель встряхивают в 2,57. †н ЯР 40® в течение 1 ч и затем в воде в .течение

2 ч. После встрахивания каждую полосу ми. рации отделяют вырезанием и режут на полоски шириной 2 мм в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Каждую полоску культивируют с L êëåòêàìè и оценивают цитотоксическую активность по отношению к L-клеткам, В той полосе, где микрировали супернатант клеточной культуры, содержащей эндотоксин,цитотоксическую активность против L-клеток обнаруживают в положении, соответствующем молекулярному весу 17500, В других положениях цитотоксичность не обнаруживают.

Клеточную культуру инкубируют в течение 2 ч после прибавления эндотоксина, после чего центрифугируют и собирают клетки. Экстракцию цитоплазматической PHK из собранных клеток, экстракцию м-PHK проводят из цитоплазматической РНК. К Зх10 кл. прибавляют 4 мл 4 M раствора гуанидинтиоцианата и смесь измельчают с .помощью гомогенизатора. Остатки удаляют центрифугированием и растворяют в смеси 2,4 г хлорида цезия. Смесь осторожно выливают в полиалломерную пробирку, куда предварительно прибавляют 2,5 мл раствора, содержащего

5,7 M хлорид цезия и 0,1 M ЭДТУ (рН

7,5), и затем подвергают ультрацентрифугированию при 30000 об/мин в течение 12 ч при 20 С. После прибавле5 ния супернатанта осадок растворяют в 1 мл 10 мМ буфера Трис-НС1, содержащего 5 мМ ЭдТУ и 17 мас./об.7 ДСН.

Результирующий раствор экстрагируют смесью хлороформ: I-бутанол (4:! по объему) . К водной фазе прибавляют

0,05 объема 2 М ацетата натрия и

2,5 объема этанола и оставляют стоять при 20 С в течение 2 ч или дольше, в результате чего РНК выпадает в осадок. Осадок собирают центрифугированием, сушат и растворяют в 500 мкл стерильной воды. В результате получают раствор цитоплазматической PHK.

Полученный раствор РНК нагревают

20 при 68 С в течение 2 мин, а затем быстро охлаждают. К раствору прибавляют 500 мкл 10 мМ буфера Трис-ЭДТУ двухкратной концентрации (рН 7,4), смесь наносят на 200 мг олиго-d-T25 целлюлозы, набитой в колонку, и промывают 10 мл того же самого буфера (единократной концентрации). Оставшееся в колонке соединение элюируют

2 мл элюирующего буфера, содержащего

3р 10 мИ Трис-НСI буфер (рН 7,4), 1 мМ

ЭДТУ и 0,1 мас./об.7 ДСН. К элюенту прибавляют 0,05 объема ацетата натрия и 2,5 объема этанола и смесь охлаждают при -20 С для образования о осадка. Осадок собирают центрифугиро35 ванием, наносят на колонку с олигоd — I — целлюлозой и собирают фракции, адсорбирующиеся на олиго-d-T-целлюлозе. Выделяют 85 мкг м-РНК, как пока40 зывает анализ ультрафиолетового спектра.

880 мкг РНК растворяют в 250 мл воды, и результирующий раствор слоем наносят на 10 мл 5-257.-ного линейно45 го сахарозного градиента плотности.

Градиент плотности сахарозы получают с использованием Трис-буферных растворов, содержащих 25 мИ Трис-НС1 (рН 7,2), 2 мМ ЭДТУ, 1 мас./об.X ДСН и соответственно 5 и 257 сахароэы.

Проводят ультрацентрифугирование при 40000 об/мин в течение 12 ч при

4 С и отбирают фракции, каждая из коо торых имеет объем 400 мкл, с помощью аппарата выделения фракций, после чего проводят осаждение этанолом.Осажденные фракции центрифугируют и растворяют в стерильной воде. менты, отщепленные трипсином.

ФНО высокой степени очистки и его, отщепленные трипсином фрагменты обес— соливают на колонке с Sephadex-25, после чего лиофильна высушивают. Очищенный ФНО и отщепленные трипсином фрагменты подвергают разложению по

Эдману с N-окончания. Каждую отщепляемую аминокислоту на каждой стадии анализируют обычным способом с помощью хроматографа высокого давления, модель $Р8100. В результате устанавливают, что ФНО имеет следующую Ч—

20 концевую аминокислотную последовательность: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-LeuSer-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-ValAla-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Glu-LeuGln-.

25 Один из отщепленных трипсином фрагментов имеет следующую концевую аминокислотную последовательность:

Glu-Ths-Pro-Glu-Glu-А1а-Glu-Pro-МetAla.

30 Олигодезоксинуклеотиды, компле— ментарные к последовательности оснований м — РНК, рассчитанной из амино. кислотной последовательности кроличьего ФНО, синтезируют в соответ— ствии с усовершенствованным фосфотри— эфирным способом ° При получении олигодезоксинуклеотндов, 128 олигодезоксинуклеотидов, рассчитанных из аминокислотной последовательности

4п кроличьего ФНО, классифицируют по пяти группам, а именно группам 16, l6 32, 32 и 32, и синтезируют в виде смесей олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп. С полученных

45 олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп снимают защиту обычным способом и их очищают колоночной хроматографией на Sephadex-50 электрофорезом на 20 мас.7. полиакриламид— ном геле, содержащем 7 М мочевину, и колоночной хроматографией с использованием Е52. Полученные таким обра3оМ олигодезоксинуклеотиды сооТВеТ ствующих групп подвергают диализу против буФерного раствора 0,1 мМ

Трис-ЭДТУ.

В каждый из очищенных олигодезоксинуклеотидов соответствующих групп вводят радиоактивную метку с исполь11 !60

Проводят трансляцию м-РНК с использованием осцитов Xenopus laevis

Фракционнрованную м-РНК растворяют и стерильной воде с получением концентрации 1 мкг/мкл и раствор вводя в социты в небольшом количестве (50 нл на клетку), Затем клетки культивируют 24 ч в растворе Барса (содержит 7,5 мМ Трис-НС1, рН 7,6, 88 мМ ИаС1, 1 мМ КС1, 0,33 мМ нитрата кальция, 0,41 мМ хлорида кальция, 0,82 мМ сульфата магния, 2,4 мМ бикарбоната натрия, 18 ед/мл пеницил— лина G и 18 мкг/мл стрептомицина), содержащем бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл. Осциты измельчают в культуральной среде с помощью стеклянной палочки. После этого культуральную жидкость центрифугируют и супернатант испьггывают на цитотоксическую активность против

L-клеток, м-PHK транслируемая с получением полипептида, обладающего максимальной активностью, по данным седиментационного анализа имеет размер 16S, Активность подавляется анти-ФНО антителом.

С использованием 5 мкг фракционированной м-PHK получают двунитиевую

ДНК. Двунитиевую ДНК фракционируют по размерам на 3,57.-ном полиакриламидном геле и получают 530 нг фракции, имеющей размер приблизительно !

000-2000 п.о. 7 нг этой фракции удлиняют дезокси-С-остатками с использованием концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, ренатурируют с по мощью 56 нг плазмиды рВе 322,которую расщепляют PstI, и удлиняют остатками лезокси-С, Ренатурированную таким образом смесь вводят в штамп !

?.coli К-12 (НВ!01, АТСС 33694) для трансформации штамма. В результате получают 12000 трансформированных организмов.

Кроличий ФНО подвергают электрофорезу на полиакриламидном геле с до децилсульфатом !а для очистки, Часть

:".еля окрашивается Кумасси бриллианто вым голубым, Полосу в месте,соответ=твующем молекулярному весу 17000, зырезают из геля и экстрагируют

17-ным раствором бикарбоната аммония

В виде белка выделяют приблизительно 180 мкг ФНО.

150 мкг выделенного ФНО растворяют в 75 мкг !Е-ного раствора бикарбоната аммония, после чего прибавля7690 ют 3 мкг трипсина TPCK. Смесь инкчбируют при 37 С в течение 4 ч, После этого смесь фракционируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на колонке и получают фраг13

)6 зованием Т вЂ” полинуклеотидкиназы и

32Р-аденозинтрифосфата по известной методике и затем очищают колоночной хроматографией с использованием

DE52. Радиоактивное соединение вводят в каждый иэ нуклеотидов соответствующих групп в количестве приблив зительно Зх10 имп/мин на 1 мкг. м — PHK клеток, вырабатывающих ФНО, обрабатывают раствором, содержащим

1 И глиоксаль, 10 мЧ NaHgO и

50 об.7 диметилсульфоксида, при 50+C в течение 60 мин и затем фракционируют с использованием электрофореза на 1,1 мас.7 агарозном геле. Фракционированную м-РНК переносят на фильтр электрофоретического типа для получения отпечатков. После этого м-РНК на фильтр обрабатывают раствором 5 х раствор Денхардта, содержащим раствор 5 х SSC, 0,75 M NaC1 + 0,075 И цитрат натрия, -рН 7 ° 150 мкг/мл денатурированной лососевой сперматоэоидной ДНК, при 65 С в течение 2 ч и затем обрабатывают раствором 5 х р-р

Денхардта, содержащим Iх10 имп/мин

7 на 1 мл меченых олигодеэоксинуклеотидов, и раствором 5 x SSC npu

50 С в течение 2 ч. Полученный таким образом фильтр промывают раствором

6 х SSC (0,9 М 11аС1 + 0,09 М цитрат натрия), рН 7, четыре раза,последова— тельно при комнатной температуре, 40, 50 и 60 С. Устанавливают, что олигодезоксинуклеотиды, обозначенные как проба MI наиболее сильно гибридизуются с м-РНК, зто указывает на то, что олигодезоксинуклеотид, имеющий последовательность оснований, полностью комплементарную,м-PHK,содержится в олигодезоксинуклеотидах, обозначенных как проба MI. ДНК трансформированных организмов гибридизус ют с меченым олигодезоксинуклеотидом (пробой MI) . Отбирают 49 колоний, сильно гибридизирующихся с мечеными олигодезоксинуклеотидами (проба MI) и затем фиксируют на другом нитроцеллюлозном фильтре. После этого с использованием 49 колоний проводят дальнейшую гибридизацию и отбирают

9 колоний, наиболее сильно гибридизуемых мечеными олигодезоксинуклеоти- дами (пробой MI), Из 9-ти колоний получают приблизительно по 5 мкг плазмид, Каждую из полученных плазмид расщепляют с использованием рестрикционных фермен07690

14 тов ?st l, TaqI, RsaI и PvuII, После этого фрагмейты, полученные расщеплением с помощью соответствующих рестрикционных ферментов, сравнивают с учетом их длины.

Результаты показывают, что все девять штаммов, соответствующих девяти колониям, имеют последователЬность оснований фрагмента, отщепляемого PvuII u RsaI и состоящего иэ приблизительно 50 п.о., и что большинство иэ 9 штаммов содержат последовательность оснований фрагмента, отщепляемого RsaI и состоящего из приблизительно 200 п.о. Результаты свидетельствуют о том, что девять ./ штаммов имеют частично одинаковую последовательностЬ оснований.

20 Семь штаммов, содержащих плаэмиды, указанные в табл.1, отдельно культивируют в 2 мл LB-среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, до тех пор, пока оптическая плотность растворов не достигнет значений, укаэанных в табл.I после чего проводят центрифугирование и получают соответ,ствующие штаммы. Каждый из полученных штаммов отдельно прибавляют к

30 2 мл физиологического солевого раствора и разрушают ультразвуком. Полученные растворы центрифугируют и определяют цитотоксическую активность полученных супернатантов против Ь клеток. Результаты представлены в табл,I. 3 пустом опыте воспроизводят вышеуказанную методику с использованием штамма, содержащего плаэмиду

pBR 322.

4р Цитотоксическая активность против

L-клеток подавляется анти-ФНО антителом, но не подавляется нормальной с мышиной сывороткой. Это указывает на

В то, что все девять вышеуказанных ко45 лоний имеют плаз иды, содержащие олигодезоксинуклеотиды, кодирующие ФНО.

Штаммы Е.coli, содержащие плазмиды рВ 2-7 и pR 13, культивируют в

1 л среды И9, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина. Плаэмиды выделяют в количестве приблизительно 150 мкг.

Последовательность оснований вставки каждой плазмиды определяют по химической методике 11аксама-Гильберта.

Таким образом, выясняют полную последовательность кроличьего ФНО.

На этой стадии проводят конструирование плазмиды с использованием рекомбинантной плазмиды pR 12 с йолу15!

607690!

6 чением прямой экспрессии ФНО в Е. coli с использованием lac в качестве промотора. Первые 10 мкг плазмиды

pR 12 расщепляют с помощью 10 ед, Apa I при 37 С в течение 2 ч и подвергают электрофорезу на 4 мас.7 полиакриламйдном геле, выделяя фрагмен1 ты длиной 610 п.о. Путем электроэлюирования из геля выделяют приблизительно 1 мкг фрагментов.

Синтезируют два олигодезоксинуклеотида; 5! -GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC3 и 5 1-ССАСЛАССТСАСАТСЗ . После этого каждое 5! -окойчание олигодезокси- 15 нуклеотидов (приблизительна 00 пикомоль) фосфорилируют с использованием Т4 — полинуклеотидкиназы. После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом и затем хлоро- 20 формом. Затем полученные синтетичес— кие олигомеры смешивают с 0,5 мкг Ара

I-фрагмента длиной 630 п.о, и проводят высаживание этанолом. Фрагменты связывают с синтетическими олигомера- 25 ми при 4 С в течение ночи с использованием 10 ед. Т -ЛНК-лигазы. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом и расщепляют 20 ед.

BamHI при 37 С в течение 3 ч, после 30 чего проводят электрофорез на 4 мас.7 полиакриламидном геле и электроэлюированием выделяют фрагменты длиной

670 п.о. 1 мкг коммерчески доступной плазмиды-pUC-8 Расщепляют с помощью

BamHI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. 0,5 мкг полученного вектора связывают с помощью

Т4-ДНК-лигазы с получением вьнпе фрагментом, имеющим сай гы BamHI на обоих концах и содержащим приблизительно

670 пар оснований, кодирующих ФНО.

Е.coli H101 трансформируют с использованием полученного выше вектора и 45 культивируют на агаровой среде,содержащей мМ ИПТГ и 0,004 (мас./об.)

x — гал, с получением приблизительно

200 белых колоний. Из 100 этих трансформированных организмов получают плазмидную ДНК и расщепляют ее с помощью ВатпН1. В результате устанавливают, что 15 плазмид содержат, как и предполагалось, BamHI-фрагмент (около 670 п.о.). Для проверки направления инсерции 15 вьппеуказанных плазмид расщепляют,co RI имеющей лишь один сайт узнавания в pUC-8 и PVUII имеющий лишь один сайт узнавания в фрагменте длиной приблизительно 670 пар оснований, и подвергают электрофорезу на б мас.7 полиакриламидном геле. В результате устанавливают,что

7 плазмид имеют, как и предполагалось, фрагмент, состоящий из приблизительно 140 п.о., и что направление транскрипции промотора lас íà pUC-8 согласуется с направлением транскрипции олигодезоксинуклеотидов, кодирующих

ФНО °

Анализ последовательности ПНК показывают, что / плазмид имеют одинаковые последовательности и содержат нужную нуклеотидную последовательность в переходах между lас-промотором, синтетической ДНК и к-ДНК.

Конструирование других плазмид проводят с использованием рекомбинантной плазмиды pR 17 с получением прямой экспрессии ФНО в F..coli c использованием 1асГ/ 5 в качестве промотора. Сначала 10 мкг плазмиды

pR 17 Расщепляют 1О ед. ApaI npu

37 С в течение 2 ч, годвергают электрофорезу на 4 мас.7. полиакриламидном геле и выделяют фрагменты, содержащие приблизительно 630 п.о. 11римерно

l мкг фрагментов выделяют из геля электроэлюированием. Синтезируют два олигодезоксинуклеотида: 5

AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3 и 5

CGAGAAGCTGACATG-3 . После этого каждое из 5 -окончаний этих двух олигодезоксинуклеотидов (приблизительно

100 пикомоль) фосфорилируют с использованием Тп — полинуклеотидкиназы. После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, Далее синтетические олигомеры смешивают с 0,5 мкг предварительно полученного из плазмиды pR 17 и осажденного этанолом ApaI-фрагмента (приблизительно 630 п,с.). Фрагмент связывают с синтетическими олигомерами при 4 С в течение ночи с использованием 10 ед. Т4-лигазы.После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом, расщепляют

20 ед. EcoRI при 37 С в течение 3 ч и затем проводят электрофорез на

4 мас.7. полиакриламидном геле и электроэлюированием выделяют фрагмент (приблизительно 670 и.о.).

1 мкг РОР95-15 расщепляют с лов мощью FcoRI, экстрагируют фенолом, затем хлороформом, после чего осаждают этанолом и получают вектор. С

16076 использованием Т4.-ДНК-лигаэы 0,5 мкг полученного вектора связывают с фрагментом (около 670 п.о.), полученным связыванием синтетического олигонуклеотида с олигонуклеотидом, 5 кодирующим ФНО. 1М101 (АТСС 33876) трансформируют с использованием полученного вьппе вектора и культивируют н среде, содержащей 1 м!! ИПТГ и !р

0,004% (мас./об) х-гал, с получением приблизительно 150 малых колоний.

Плазмидную ДНК получают из 100 этих колоний и расщепляют с помощью

EcoRI. В резул;тате устанавливают, что 12 плазмид содержат предполагаемый EcoRI-фрагмент (приблизительно

670 п.о,). Для проверки направления инсерции 12 вьппеуказанных плазмид расщепляют с помощью Рчц1? и Pstl и подвергают электрофорезу на

1,5 мас.% агарозном геле. В результате устанавливают, что четыре ггпазмиды содержат целевые фрагменты (приблизительно 1280 п.о, и прибли- 25 зительно 2600 п.о.) и что направление транскрипции промотора lac UV5 согласуется с направлением транскриггции олигодезоксинуклеотидов,кодирующих ФНО. 30

Ана из последовательности оснований показывает, что эти четыре плазмиды имеют одинаковую последовательность и что промотор lac UV5, синтетический олигодезоксинуклеотид и к-ДНК соответствующим образом соче20

Количество мышей, совершенно излечившихся от опухоли

Доля выздоровевших

Количество мышей, использованных для испытdния гируют и суспендируют в смеси 2 мл

45 вышеуказанной смеси, содержащей

0,1 M МОПС (рН 6,5), 50 мМ САС1, 10 мМ КЪС1 и 30 мкл ДМСО. К аликвоте результирующей суспензии объемом

200 мкл отдельно прибавляют по 10 мкл

5р каждого из растворов плазмидной ДЙК.

Каждую из результирующей смесей ох. ° лаждают на льду в течение 30 мин и затем нагревают при 44 С в течение

60 с. Непосредственно после этого

55 к каждой из нагретых смесей прибавляют по 5 мл предварительно нагретой до 37 С LB-среды, после чего проводят инкубирование при 37 С в течение

1 ч, Каждый из полученных культуральРезультаты представлены в табл.2.

Пример 2. Колонии E.coli К12 штамма МС1061 трансформируют плазмидами pR 18, рВ 2-7 и рЕ 2-2. Колонию штамма МС1061 Е.coli культивиру- . ют в среде ЬВ до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона при 550 нм не достигнет значения 0,3.50 мп выросшей культуры

Е.coli собирают, промывают 25 мл .смеси, содержащей 10 мМ МОПС (рН 6,5) и 10 MM RbCl, и снова суспендируют в 25 мл смеси, содержащей 0,1 M МОПС (рН 6,5), 50 мМ СаС10 и 10 MM RbC1.

Результирующую суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифутаются друг с другом. Полученные плаэмиды обозначают как рФНО lас

UV " — 1.

Штаммы Е.coli, содержащие плазмиды, культивируют в 50 мл ЬВ-среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, при 37 С в течение ночи ° Затем штаммы переносят в 5 л

LB-среды, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и дополнительно культивируют при 37 С в течение 3 ч. К ней прибавляют изопропил †-D-тиогалактопиранозид в результирующей концентрации 1 мМ. Культивирование продолжают еще в течение

6 ч, после чего проводят охлаждение.

3атем штаммы собирают центрифугированием. Прибавляют в 5 л буферного раствора 0,04 I". Трис-НС1 (рН 7,8), разрушают ультразвуком и получают раствор белков штамма. Полученный раствор обладает цитотоксической активностью против L-клеток, равной

5x I 07 ед. /л.

Полученный раствор очищают таким же образом и получают 1,2х10 ед.

ФНО. Удельная активность ФНО равна

6,8х10г ед./мг.

Образец (0,2 мл) ФНО испытывают способом анализа in vivo.

Через 20 дней после инъекции образца делают осмотр дегенерации опухолей и рассчитывают долю выздоро— вевших по следующей формуле.

07690 20

19

16 ных бульонов центрифугируют с образованием клеточного осадка. Супернатант отбрасывают, прибавляют LBсреду и каждый из клеточных осадков суспендируют перемешиванием, Каждую из результирующих суспензий высевают на LB-пластинку агара, содержащую тетрациклин в концентрации 30 мкг/мл, и затем инкубируют при 37 С в течение ночи. В результате получают колонии трансформированных организмов, устойчивых к действию тетрациклина, каждая из которых трансформирована плазмидами pR 18, рВ 2 — 7 и рВ 2-2.

Трансформированные штаммы плаэмидами рБ 2-7 и pR 18 подвергают следующим операциям: выращивания трансформированного организма, сбор и лизирование трансформированного организма и очистка плазмидной ДНК по методике. Каждый из трансформированных штаммов высевают в ЬВ-среду и инкубируют при 37 ОС и интенсивном встряхивании. Эту стадию повторяют для выращивания трансформированного организма и амплификации плазмнд.Культуру трансформированного организма собирают центрифугированием при

4000g в течение 10 мин при 4 С.Супернатант отбрасывают. Результирующий осадок промывают 100 мл охлажденного на ледяной бане НТЭ (0,1 М 11аС1, 10 мМ Трис-НС1, рН 7,8, и 1 мМ ЭДТУ) и лизируют кипячением с использованием 20 мг/мл лизоцима в 10 мМ ТрисНС1, рН 8,0. Вязкий продукт переносят в пробирку ультрацентрифуги и центрифугируют при 25000 об/мин в течение 30 мин при 4 С и получают раствор ДНК. Измеряют объем раствора

ДНК. На каждый миллилитр прибавляют точно 1 г твердого хлорида цезия и осторожно перемешивают до полного растворения соли. На каждые )О мл раствора хлорида цезия прибавляют

0,8 мл раствора бромистого этила (водный раствор с концентрацией

10 мг/мл). Результирующая плотность раствора равна 1,55 г/мл, а концентрация бромистого этила равна приблизительно 600 мкг/мл. Раствор хлорида цезия переносят в пробирку для центрифугирования и оставшуюся часть пробирки заполняют легким парафиновым маслом. Проводят центрифугирова— ние при 45000 об/мин в течение 36 ч при 20пС и получают две полосы ДНК, где верхняя полоса состоит из линей10

55 ной бактериальной ДНК и меченой кольцевой плаэмидной ДНК, а нижняя полоса состоит из замкнутой кольцевой плазмидной ДНК. Нижнюю полосу

ДНК собирают в стеклянную пробирку с помощью иглы для подкожных инъекций, введенной через боковую стенку пробирки. Бромистый этил удаляют и водную фазу подвергают диализу против ТА3. Раствор плазмидной ДНК обрабатывают PHK-азой и экстрагируют равным объемом фенола. Водную фазу слоев наносят на колонку, уравновешенную по отношению к ТАЗ (pH 8,0) и O,IZ ДСН.ДНК в колонке промывают и наносят ТЕ с 0,17 ДСН для сбора фракций. Фракции осаждают этанолом и получают чистую плазмидную ДНК.

По вьппеуказанной методике получают 250 мкг чистой ДНК плаэмиды рВ

2-7 и 134 мкг чистой ДНК плазмиды

pR 18.

ДНК плазмиды рВ 2-7 (40.мкг) расщепляют рестриктазой PstI и подвергают электрофорезу на 47-ном акриламидном геле. После электрофореза

ДНК окрашивают и нужную полосу вырезают для получения вставки PstI.

С использованием 500 нг выделенной вставки PstI проводят трансляцию с меткой и 80 пикомоль радиоактивного dCTP прибавляют в 25 мкл реакционной системы (при 400 кюри/ммоль). смеси, состоящей из 2,5 мкл раствора А (раствор dNTP), 2,5 мкл раствора В (500 нг испытуемой JIHK,а именно вставки PstI) 5 мкл меченой dCTP (3200 кюри/ммоль), 1,3 мкл ЙСТР без метки (65 пикомоль, 50 гмоль/мкл

dCTP), 11,2 мкл раствора Е (вода), всего 22,5 мкл, прибавляют 2,5 мкл раствора с ДНК-аэу 1, ДНК-полимеризу 1 и проводят реакцию при 15 С в течение 60 мин. После этого для прерывания реакции к результирующей смеси прибавляют в качестве носителя т-РНК, дважды переосажценную этанолом и растворенную в 500 мкл воды.

Идеальная активность на 1 мкг ДНК равна 9,3xIO имп/мин.

Т

Вьппеописанные операции повторяют также с чистой ДНК плазмиды pR 18 для проведения трансляции с меткой.

Удельная активность íà 1 мкг, IHK рав-, на 7х10 мин/мин.

80 мкг ДНК плазмиды рР. 18 расщепляют рестриктазой RsdI и подвергают электрофорезу на полиакриламидном

16076 геле. Указанные ниже полосы пелевых вставок вырезают и очищают на колонке: приблизительно 640 п.о., 3