Штамм вируса эпидемического паротита рубини, используемый для получения живой вакцины против эпидемического паротита, и способ его получения

Штамм вируса эпидемического паротита рубини, используемый для получения живой вакцины против эпидемического паротита, и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к адаптированным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитом. Целью изобретения является снижение реактогенности вакцины. Получение штамма вируса эпидемического паротита Рубини C.N.C.M. N 1 =503 заключается в следующем. Вирус выделяют у больного свинкой, выращивают на диплодных клетках человека, аттенуируют на диплоидных клетках человека и развивающихся куриных эмбрионах, после чего дополнительно аттенуируют на тех же диплоидных клетках человека, собирают и накапливают. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4028033/30-13 (22) 22.08.86 (31) 133/86 (32) 15. 01 . 86 (33) СН . (46) 30. 11. 90. Бюп. K 44 (71) Ывейцеришес серум — унд импфинститут унд институт цур эрфоршунг дер инфекционскранкхейтен (СН) (72) Рейнхард Глюк и 1 эне Жерманье (СН) (53) 576.8.094.29(088.8) (56) Патент Ивейцарии N 475355, кл. С 12 N 7/00, 1968.

Патент Glib N - 3961046, кл. А 61 К 39/12, 1976., (54) ЫТАММ ВИРУСА ЭПИДЕМИЧЕСКОГО nA—

P0THTA PVBHHH, ИСПОЛЪЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУИзобретение относится к адаптированным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита и к способу их получения из вирулентных вирусов эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитом.Цель изобретения — снижение реак— тогенности вакцины„

Для этого используэт ытамм вируса эпидемического паротита Рубини С N С М

N 1-503.Птамм депонирован в коллекции института Пастера С N С М г. Париж под Nl- 1-503. штамм вируса эпидемического паротита Рубини С N С H N 1-503 характеризуется следующими сво11ствами.

Морфология.. Парамиксовирус, эпидемический паротит.

Электронно-микроскопически вирус эпидемического паротита штамма 1 убини (51)5 С 12 N 7/00, 7/08

ЧЕН1И НИВОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭПИДЕИ1ЧЕСКОГО ПАРОТИТА, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (57) Изобретение относится к адаптиро— ванным к человеческим клеткам вирусам эпидемического паротита, выделенным у больных эпидемическим паротитом., Цель изобретения — сн1юкенпе реактогенности вакцины. Получение штамма вируса эпидемического паротита Рубини

С.N.Ñ.11. 11 - 1-503 заключается в следующем. Вирус выделяют у больного свинкой, выращивают на диплоидных клетках человека, аттенуируют на диплоидиых клетках человека и развивающихся куриных эмбрионах, после чего дополнительно аттенуируют на тех же диплоидных клетках человека, собирают и накапливают. 2 с,п. ф-лы, 1 табл. обнаруживает оболочку и поль1е спиральные нити, образующие нуклеокалсид.

Частицы имеют нитевидную структуру.

Репликация. 111тамм Рубили можно реплицировать в диплоидных клетках человека, например в клетках типа 1ЖС-5 (Cell Bank of the Swiss Serum — and

Vaccine Institute Berne). Питательная среда: Basal Nedium (Eagle): GIBCO, USA, СаС. 1"- G — В), FCS (Rehatuin) 10%.

Среда для сохранения культуры: среда

199: GIBCK, USA, Cat. 1 - Е-12) HSA

0,25% в трипсине 1:250, 0,25% в PBS (рН 7,4) DIFCO, USAИммунологические свойстга приведены в табл1ще„

Клиническая оценка гакцины штамма

Рубини против эпидемического паротита в смеси с вакциной IIpo TI III кори, содер—

1611? 18 жанцей вирусы кори штамма Е7.-19, «3, кциной против краснухи, Фи. Зико химичеcкиe своистла, 11аp<н— миксовирус включает ДНК геном с пс3ерхностью, состоящиЙ из белков, липидов и углеводородов, Они жизнесгособны в пределах значений рН 6,0

8,0 и выживают при температурах до о 10

45 С при условии, что их защищают добавочными углеводородами (такими как глюкоза, лактоза и/или сахаро.3а),.

Получение вируса штамма Рубили, Выделение и перенос вирулентного

15 вируса эпидемического паротита.

Выделение вируса из мочи заболев— шего свинкой пациента сн уществляют ультрацентрифугированием (4 ч, 25000 об/мин). Полученную фракцию, 20 содержащую вирусы, испытывают в реакции гемагглютинации, культивируют в диплоидной человеческой тка3 и (напри— мер, в культурах типа Wi — 38) и в насиженных куриных эмбрионах. Полученный таким образом вирус свинки затем очищают и концентрируют ультрацентрифугированием в течение 4 ч при 25000 об/мин.

Аттенуирование и адаптация вируса.

Для аттенуирования и адаптации вышеуказанный посевной материал вируса

30 эпидемического паротита подвергают дополнительным пассажам в куриных эм" брионах и затем в человеческих клетках, осуществляя следунзщие операции: неоднократные пассажи в амниотическом или аллантоисном мешках или попеременно в куриных эмбрионах соответственно при 30-35 С (например,32,); дополнительнь.е пассажи в диплсидной человеческой ткани типа ГАС-5 при 30 С; повторные пассажи в тканевых культурах этого же типа (ИКС-5) при 35 С„ сО

Получение вакцины. 45

Полученный в результате вышеуказанных следующих друг за другом пассажей посевной вирус размножают в диплоидных человеческих клетках, например клетках MRC — 5.

Затем собирают взвесь вирусов и перебрасывают ее до готовой к употреблению вакцины.

В этих целях взвес:ь осветляют, например, путем центрифугирования или фильтрации, после чего определяют содержание вирусов, например, в клетках

VER0, стабилизируют материал путем до

-добавки сахара, например глюкозы., лактозы и/или сахаро.-3ы, после пегo ее, наконец, подвергают лио нилизации:

Число IIaññ ажей в»руса II дип.3оиднои человеческой ткани и в куриных эмбрионrIx можно варьиро.Зать .. Температуру во время выращивания и культивирова— ния тоже можно варьировать примерно о в пределах 30 и 38 С,.

Лттснуирование и культивирование вирусов преследует две главные цели: ослабление вирулентности вируса с сохранением его антигенных свойств, т.е„ способности вызывать образование à!I THTPJI > выработка ослабленной культуры вирусов, не содержащей постороннего белка, т.,е. в данном случае »е содержащей птичьих белков, и следов антибиотиков,.

II р и м е р 1- Получение вируса штамма Рубини.

A. Получение посевного вируса.

Вирусы эпидемического паротита, полученные к концу времени из мочи заболевшего свинкой больного, очищают путем дифференциального центрифугирования и ультрацентрифугирования (4 ч, 25000 об/мин) и концентрируют их, 3атем с использованием реакции гемагглю— тинации определяют содержащую вирусы свинки фракцию, мешан3т ее в содержащую белок среду„ например Basal Medium Eagle (БГБ) фирмы Gibco + 0,47. человеческого сывороточного альбумина (!БА), и подвергают дальнейшей пере— работке,. Г1онослой диплоидных человеческих клеток (например, из vli-38) засевают взвесью вирусов свинки и после добавки питательной среды, например

HME + 102 эмбриональной бычьей сыворотки (I BS), инкубируют при 37 С. Че— рез несколько суток собирают вирус.

Последний еще подвергают 1 †4 †крат пассажу в диплоидных человеческих клетках. Далее собранный материал подвергают трехкратному пассажу в куриных SPF эмбрионах с применением различных методов засева и сбора: инокуляция в аллантоисный мешок и сбор из него„ инокуляция в амниотический мешок и сбор из него инокуляция в амниотический мешок и сбор из аллантоисного или амниотического мешка соответственно, Яйца инкубируют при температуре о, 33 пределах 32-35 С, Полученные в результате трех пассажей в яйцах по 8 вариантам инокуляции и сбора вирусы объединяют, Объединенный материал

1611218

20

55 подвергают 10 qorrozkrrrvezr,rrbrkr пассажам в яйцах: инокулируют в амнистический мешок и собирают вирусы из аллантоисной жидкости, Температуру поддерживают при 32 С., Титр антигенов вируса свинки в каждом случае определяют в реакщьи гемагглютинащги.

Затем осуществляются 4 быстрых пас"ажа в диплоидных человеческих клетках (1 РС-5) при 30 С (каждый пассаж около 7 сут),, После 9 дополнительных пассажей в клетках MRC-5 при 35 С (на каждый пассаж 10-20 сут) получают аттенуированный посевной вирус.

b„ Проверка посевного вируса,.

Полученный в результате аттенуирования посевной вирус подвергают испытанию для определения идентичности его с вирусом свинки (реакция нейтрализации на клетках VHRO) и для установления его концентрации (титр в клетках ВЕКО: 5,6 log î 11 5оr ìë)., Идентификация посевного вируса подтверждает наличие вируса свинки, Титр указывает на то, что получение вируса на клетках MRC — 5 с использованием вируса свинки штамма Рубини возможно,.

Кроме того, нижеприведенными тестами подтверждена микробиологическая чистота посевного вируса: тесты на среде о жидкого тиогликолята при 30-32 С; отсутствие бактерий; тесты на жидкой соевой среде при 20-25 С; отсутствие грибков; тесты на жидкой и плотной средах; отсутствие микоплазм, тесты ин виво на морских свинках: отсу гствие Hycobact. tuberculosis; тесты ин виво на жидкой (по Сантону) и на плотной (по Левенштейн-Йенсену) средах: отсутствие М. tuberculosis; тесты на птичий лейкоз: отсутствие ретровирусов; тесты на посторонние вирусы ин виво на обезьянах (Cynomologus) морских свинках, мышах, новорожденных мышах (не старше 24 ч) и криных эмбрионах: отсутствие посторонних вирусов; тесты на посторонние вирусы ин витро на первичной обезьяней почке (Primary monkey kidney) и в диплоидных человеческих клетках (HDC) (IIRC-5) и Lung-18: отсутствие посто— ронних вирусов.

В. Получение вирусов в клетках.

Посевные вирусы размножаются в диплоидных человеческих клетках, например клетках типа MRC-5, в пригодных для крупнопромышленного производства культуральных бутылях, например бутыля. -качалках. После инкубации при

„0

Зэ С в течение 7-10 сут и микроскопической оценки культуры (эффект цитопатогенности) собирают взвесь вирусов с суточным интервалом в течение 7 дней.Затем объединенную массу вирусов хранят до получения результатов испытао ний при — 190 С в газовой фазе жидкого азота„ Вирусный материал, котopbrrr IIO результатам испытаний соответствует требованиям, вновь размораживают и фильтруют до прозрачности с помощью фильтра с размером пор ок. 5 мкм. После разбавления вирусного материала стабилизатором,.представляющим собой раствор лактозы или лактозы и глюкозы, содержащий человеческий сывороточный альбумин, получают конечный материал, который порциями по- 0,5 мл разливается в бутылочки емкостью 3 мл и в замороженном состоянии лиофилизуется, Г„ Клинические исследования.

Проведенные до сих пор исследования показывают, что прививка вышеописанным материалом оптимально переносится человеком, Повышение температуpf)1 или какие — либо местные реакщш Не наблюдаются., Чувствительные органы, например околоушные слюнные железы или яички, не пока зывают никаких припухлостей, воспаления или болевых реакций., За исключением одного все пробанды показывают положительную cepoKoiiHepcHIo, Единственный пробанд, у которого при повторном исследовании не удалось обнаружить специфических для свинки антител, уме до этого реагировал отрицательно на комерческие прививочные материалы против свинки.

В другом клиническом исследовании полученный вирусный материал в виде комбинированной вакцины на основе живого вируса в человеческих диплоидных клетках (HDCV) против свинки, ко— ри и краснухи испытывают в полевых усло— виях по методу двойного слепого опыта.

В исследование включают всего

120 детей раннего возраста (15 — 20 мес)

60 детям вводят новую вакцину, а контрольной группе из 60 детей — известную вакцину против свинки, кори и краснухи М-М-R III. Через 6-8 недель после вакцинации у обеих групп без исключения устанавливают высокую степень сероконверсии (95-1007). Инои жественное испытание (— Тes 1: пока<> < 12!

; (< ) l < P (Г К И Х КЛ P.. Ò X 1 Х

О j) ki «) 11 л )х 3 О б p <> т е н !1.< 7 (1 (ЬП! ПЛ Я (10)1«;ЧС>1»Х Я 7!<И)3(31" »;: КЦ1(Н!>1

fJ;ч<)ского !(»рот-(T», п<.по<и -Зуемс.го

iJ!, ;:iÐÈÃОтО)3)(ЕНИЯ ж!(13 >)Х 1<ЛКИ!1)(Ь! П«<>ОЬО 3(>ac ) Г (и(нь

Г 13 0 КГ! <1<(«»си)х

1 т(х)»к(,! н 1

П) «Н

Вакцина

Trivirate3)

Вегпа

С Оде ржа. (ие. (! H c1Л О П О; !)3QP(!<В!ХС>1

»H (> VC0B !!!Т -((7<3<(<» P (« б)И !Н 10! <3

Р("(.I/,

< B» 1C t LH ) t c» l „ i1t !

) 8401

8614

8613

Сумм л

7,0

30 . °

28

1, 1 <<8

I5

3 9

98

93

1

1! .4

1

7 — 14

1

1 — 14

» ) >

+ 3

) 7> 3 <.,3

С:<ставит(=<.ь 11, 1 1«>с>с)13;1 (хрс, 11.,<;слани <

" Редактор H. 1><1(((тулинец

)(<)рр()«(! < (7 I .! аказ 3746

IJ-1>»3<(484

П 3! i TT J i < .! 1 0 (>

f11111111È Г Осул»р т»с. iiiioi o ко. !и: « i;1 .(о и»о< p<::::.,:.". 1:,:. !)тк,>ьтl<>«м: р:<

<с " < <

1 )! i!> . C 3», ) >)> I !c«<).>! i<1 .1. (рОИЗВОНС<тВЕ)1»0 И 3;1;)::1»: l«, 1 <;О !F)«IC)Г .I lт» И i i . ifÃ<,I><:i> у:! .. Л:.;>) ." :.3!)Н)л ГТ <31 (3>«Т<1 Т !31t(. < .т;3 Тl 1(1 l" i(.C 1»1« 1!;!" (И)<ХО! i РЛ 311< t) tl! 1й»l(1 11 <311<>(Г!1 д()ух 13<1)сн,ин (,р . 0, .!. 15,) ., I 3 12 у l;lc . 1)У)(>!((1(Х 13 К«(И(ПХЧЕ(КОМ IХС(:!! <11IHH TCJ(J(11!3K

5 не поступ.!

КНх-!tJTF7o побоч)п (х дсй<.т г- иях 13<1!et

НР) С <7.

1>Ь(« <7 7>(! ;)Н О)! ««ОНО t ())СЕ К <>! () (с !— ненты B!31;ITHI!»t HDC >()нару)<си!)лют ныс<— ку3(> степснь лттенуи>)онлния и что вакцш(л не содержит ни пти-(ьих бслк<)T3

И ЗКСТРЛК ТОН >(ЛХВОТНЬГХ C)C.< !.ОВ IIH Л l! тибиотик<>», Таким Образо),, отпл,.l(»ет все теоретические и (17лкт!(че<.кие

<5 прот)хвои<>к<тз(3ния, Обу<:(с: )!енн! ic coО т В т с TB «и!1! !В i и с» р!3 х l у» с 1 <> I т Г.< В 1< О с l ЯМИ с II! f! ОПНОМ (JI > »1<ае (l(» (

Г 0 М »ТЕ 13)lие- Вир <>«-7» пи<«<.lвlче<..—

КОГО пса(7 0 титл ) кл)(ОFIJ!c(3.! 0 В НРиме ре

I) . Pa(3(c<ножение )3J;pyc(: <: 13 T::.Ип.;!Оид — 25

НЫХ ЧЕ:!013 Е IЕСКИХ 1(JIC TJ<(!X, В. Лттpilуировл Bfc )зи)3(<-.013 Iiocpе;;— ном 10 пассажей Г, диплоидных челси>е"ческих клетках при 30-3 > С> 6 плс.сл> жей попеременно ь амнио.)и(еском

))ллантоисном мелках куриньгх Омбр)Г(><) нов при 35-38 С и, након< ц., 6 быстci>1)Ix )х 1 0 Обьсчных TI».cc)»it(011 и е ч О В е ч е c. TcH 3< кп е T tc Ft7., 1«(К С- > 1! j!;!

О

10 — 35 С,, 8

I, Рл )t t)1<73(01(!1(T и х:(учс 1!110 . О По Л/I>/

/ Ь п(>с: .. 1)НО(o 13T(P Yc:а 1< (и(< (О i)1 íü!х (( (F7<7p i3ttp??jc <3)3> ОТд(!C . Ill!(3 ()T К 7 л1> Г У «) ° 1. <>Ной. CP(JД)1 ОЧ)1<. Т!С КС)Н)f()! ТP 1

Цl )! if(ПЬ!ТЛНИЕ ГТ<1<>И,<ПХ:)!Ttiepy 1

1, 1<1тлмм вируса:>пи<(с (инес»c>! > иротитл Рубини С М С I ." 1 — 70 i „ i!(II(ль—

i (() O Г)Х13 !) Пl (ДЕМИНО(!COI О «1 » Р <)Тll <;1 ! Нособ по...(уче)i!iя 1)ир",«(;1 >пи..(е! !«13 )TTJT;LQ! ХИЧ((1(;)T Î П(!!>ОТJIT;3 > 3К!i В i;110

i<(< !It !3 В(1(СНЕ НИ(. 13!ГО УС: с) <)т .3(3 !Ь! 1 ОГО С;13H !i к()If )31)(17»!)В!В<1131(<а с .ГО н(1, пп! 101<,"(нь!х

К 1(Г)С»X Ч« 101< ЕК 1 > <1 Т< .НУ)!(3<3(3()НИ(3 « .(1

;LlfJTJlcQkfJIHb1X К:IP TJC 1Х Ч (3

1(3(

С Я TCYi ЧТО > )ХЕ !1>1<> C 11)Г>< .Нl<Я РС сl<с

Гогенности F3àêö и!и, 13)хрус ((<7(Jlc;3)1Р с1ПВ!13<) IIHЯ И а Гт (7<1 ))??????i><11(11!iT )< с . Кi". 1ЬТ

P(!;IHIIJ1О1Х„ ХНЫХ I.J<<1 01(iiC .!1<>13(li

ВИВ(НП!!(ИХСЯ )C>>17Hi(1)CC .3 lf>T)lii Н() 7: ЛТ Г< НуH

РУ)<)Т, OTI(3 П!П(т" 13))C ХХХ П IГ(! (» F) 1P н» i" и )1 !»сс<п ВХB11!1, ((< .11

Ч(>С )<ОГО I(Ë»)О J i <1 1)(Т»lc М РУ t))i!i!i С» (» 1

<<о 1 )0»