Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному белку вируса гепатита а человека

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклональных антител к рекомбинантному белку вируса гепатита а человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса гепатита А. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к рекомбинатному белку (РБ) вируса гепатита А (ВГА). ШТАММ ПОЛУЧАЮТ ГИБРИДИЗАЦИЕЙ КЛЕТОК МЫШИНОЙ МИЕЛОМЫ NSO с клетками селезенки мыши линии BALB/C, иммунизированной РБ ВГА. ШТАММ ДЕКОНИРОВАН ПОД НОМЕРОМ ВСКК(П) 286Д. ШТАММ КУЛЬТИВИРУЮТ В РОСТОВОЙ СРЕДЕ ДМЕ/Р<SB POS="POST">12</SB> (1:1) с добавлением 50 мкМ меркаптоэтанола, 1% концентрата аминокислот, 15MM HEPES - буфера, 10% сыворотки эмбриона коровы

в атмосфере 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Клетки пересевают 2 раза в неделю в соотношении 1:3. Клетки секретируют МонАТ класса IGG2B, взаимодействующие с РБ ВГА. ТИТР МОНАТ В АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ ТЕСТЕ ПРИ НАНЕСЕНИИ НА ТВЕРДУЮ ФАЗУ 1 МКГ/МЛ РБ ВГА составляет 10<SP POS="POST">-8</SP>. Штамм стабилен 30 пассажей.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕЮ БЛИН (19) ()1) А1 (gl)g С 12 Н 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

Il0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4641661/30-13 (22) 25.01 ° 89 (46) 07 ° 12.90, Бюл, N- 45 (71) Институт цитологии АН СССР, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Институт биоорганической химии им. М.M.Á!åìÿêèíà (72) И.И.Фридлянская, Т.Ц.Чернова, О.Н.Антропова, IO.IÎ.Кусов, Т.А.Насташенко, N.Ñ.Áàëàÿí, С.А.Царев, С.В.Маркова и Е.Д.Свердлов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Hughes et. а1. F. virol, 1984, ч.52, 2. (54) ШТАММ ГИБРИЦНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS NUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К РЕК()М

БИНАТНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА ГЕПАТИТА А

ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для диагностики вируса гепетита А.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинатному белку вируса гепетита А.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мьшшной миеломы NSO гибридизируют. с клетками селезенки мыши

2 гепатита А. Целью изобретения является получение штамма гибридных куль-, тивируемых клеток животных Миз musси1пз, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к рекомбинатному белку (РБ) вируса гепатита А (ВГА) .

Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы 1ЯО с клетками селезенки мыши линии ВА),В/С, иммунизированной РБ ВГА. Штамм декодирован под номером ВСКК(П) 1" 286Д. Штамм культивируют В ростовой среде ДМЕ/Р(2 (1:1) с добавлением 50 мкм меркаптоэтанола, 17. концентрата аминокислот, 15 мМ НЕРЕЯ-буфера, 10% сыворотки эмбриона коровы; в атмосфере 5% СО

Клетки пересевают 2 раза в неделю в соотношении 1:3. Кле".ки секретируют

МонАТ класса IgG2b, взаимодействующие с РБ ВГА. Титр МонАТ в асцитной жидкости в иммуноферментном тесте при нанесении на твердую фазу

Я

1 мкг/мл РБ ВГА составляет 10

Штамм стабилен 30 пассажей. линии BAI.Â/Ñ, иммунизированной реком— бинатным белком вируса гепатита,A (РБ BIA),÷åëîâåêà, по схеме, обеспечивающей максимальный имунный ответ для данного антигена. В результате селекции полученных клеток на среде

ГАТ, cKpHHHHr гибридом по признаку продукции антител к рекомбинантному белку вируса гепатита А и последующего клонирования отбираот штамм (ВСKK(II) Р 286Л (название HAV-1-28), стабильно продуцнрующий МонАТ к рекомбинатному белку вируса гепатита А.

161 1930

Штамм хранится в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР— ВСКК(П), регистрационный номер депонирования—

ВСКК(П) 286Д. К моменту депонирования штамм прошел 20 пассажей.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Стандартные условия выращивания. 10 Штамм культивируют на ростовой среде

ДМЕ/Г„ (1:1) с добавлением 50 мкМ меркаптоэтанола, 1 концентрата несущественных аминокислот, 15 мМ

HEPES 10% сыворотки эмбриона коровы. 15

Культуральные свойства. Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых сосудах в закрытой системе или в атмосфере 5 .-ного СО . Клетки пересевают встряхиванием 2 раза в неде- 20 лю в соотношении 1:3, Характеристика культивирования гибридомы в организме животного.

1-1 ° 10 клеток гибридомы в бессыб вороточной среде вводят внутрибрю- 25 шинно мышам линии BAI.В/С, которым за

7-10 дней до прививки инъецировали

0,5 мл пристана или вазелинового масла внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10 дней после прививки клеток. 30

Контаминация. Грибы, бактерии, микоплазма отсутствуют.

Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом. Клетки секретируют иммуноглобулины IBG26 взаимодействующие с рекомбинатным белком вируса гепатита А и цельным вирусом в твердофазном иммуноферментном тесте. Эпитоп локализуется на . фрагменте Vp1. 40

Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Титр антител в асцитной жидкости в иммуноферментном тесте при нанесении на твердую фазу

1 мкг/мл рекомбинатного белка виру- 45

-8 са гепатита А составляет более 10

Штамм стабилен около 30 пассажей in vitro и 2 пассажа in vitro (срок наблюдения).

Криоконсервирование. Клетки замораживают в ростовой кондиционированной среде с 10 ДМСО. Режим замора.живания и отогрева обычный для клеточных культур. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 70,.

Пример l. Каждая мьппь BALB/C ,предварительно получает внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Через 10 дней таким животным инъецируют гибридные. клетки., Для этого культивируемые клетки в логарифмической фазе роста стерильно:центрифугируют 7 мин при

1000 об/мин на центрифуге. Осадок клеток отмывают стерильным -раствором

Хенкса, повторно центрифугируют при тех же условиях и суспензируют снова в стерильном растворе Хенкса.

Каждой из трех мьппей внутрибрюшинно инъецируют по 0 5 мл суспензии соб

У держащей 2 ° 10 гибридных клеток.

Через 14 дней мышей забивают, из брюшной полости извлекают асцитную жидкость. Клетки из асцитной жидкости отделяют центрифугированием и используют для прививки гибридом, а в надосадочной жидкости определяют титр антител с помощью стандартного иммуноферментного анализа.

В пластины для иммунологических исследований вносят по 50 мкл раствора рекомбинатного белка (фрагмент

Vp1) в 0,1 М бикарбонатном буфере, рН 9,5 в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации в течение ночи пластины отмывают. PBS c 0,05 твина -20 и наносят асцитную жидкость с моноклональными антителами в разведении от 10 до 10 8. Через 1 ч инкубации при комнатной температуре пластины снова отмывают PBS c 0,05 твина-20 и наносят конъюгат бараньих антител к .иммуноглобулинам мыши с пероксидазой хрена (разведение 1:

:2500). После одночасовой инкубации и отмывки добавляют раствор субстра-. та — хромогена (5 мг ортофенилендиамина в 10 мл цитратного буфера рН 4,5 и 5 мкл 30% Н О ). Через 30 мин определяют оптическую плотность при

492 нм. При разведении асцитной жидкости в 10 8 раз оптическая плотность составляет 0,753, в контроле 0,004.

Таким образом, титр антител а асцитной жидкости шлмма HAV-1-28 не менее 10 8.

Характеристика ЫонАТ, продуцируг емых штаммом гибридомы 286Д.

МонАТ, секретируемые клетками гибридомы штамма 286Д, связываются как с рекомбинантным белком вируса гепатита А, так и с цельным вирусом.

Пример 2. В лунки иммунопанели вносят по 75 мкл сыворотки реконвалесцента гепатита А, разведенной в 10 раз в О, 1 м бикарбонантном буфере, рН 9,6, 1930 6

МонАТ штамма HAV-1-28 узнают не только рекомбинатные белки, но и цельный вирус гепатита А.

161

Формула изобретения

Составитель А.Маныкин

Редактор Н.Бобкова Техред g.Ходанич Корректор Т.Малец

Подписное

Заказ 3812

Тираж 493

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101.

После инкубации при комнатной темпертуре в течение 14-18 ч отмывают PBS с 0,05Х твина-20. Затем на,носят в лунки по 50 мкл .очищенного вирусагепатита А (p - 1 ° 34 CsC1) инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре, отмывают, как описано, и наносят на 14-18 ч 50 мкл в лунку моноклональных антител в культуральной среде. После отмывки панели инкубируют при тех-же условиях с пероксидазным конъюгатом козлиных антимышиных иммуноглобулинов. Затем добавляют раствор субстрата — хромогена и определяют оптическую плотность, как описано. Оптическая плотность в опыте составляла 0,528, в контроле — 0 150. Таким образом, 5 "

Методом иммуноблодтинга установлено, что как в рекомбинатных белках, так и в цельном вирусе эпитопа МонАТ

HAV-1-28 локализируется íà V 1 — осP новном поверхностном антигене вируса гепатита A.

15 Нтамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus

ВСКК(П) В 286Д вЂ” продуцент моноклональных антител к рекомбинатному бел- ку вируса гепатита А человека.