Способ получения рекомбинантной плазмидной днк phtn 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека

Способ получения рекомбинантной плазмидной днк phtn 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной ДНК PHT N 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плазмиды конструируют в результате культивирования человеческих макрофагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из и-РНК с использованием обратной траскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК PBR 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хозяина и получения клонов субклонирования к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главной части, из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную РНК PHT N 713.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) (51)5 С 12 N 15/28

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 3869300/30-1 (22) 05.03.85 (31) 43617/84 (32) 06.03.84 ..f33). JP, (46) 15.12.90. Бюл. Р 46 ..Ф . (71) Дайниппон Фармасьютикал Ко Лтд (1Р) (/2) Масааки Ямада, Ясуджи Фурутани, Мицие Нотаке и Инити Ямагиси (JP) (53) 575,224.2:577.2 (048) (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ))ЦЯ РЕКОМБИНАНТНОЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHTN 713, КОДИРУ10ЩЕЙ

ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидИзобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию рекомбинантной плазмидной

ДНК, кодирующей фактор некроза опухоли человека.

Способ заключается в том, что конструируют ДНК плазмиды в результате культивирования человеческих макро.фагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-РНК человеческого ФНО, от индуцированных клеток, получения одн-ДНК из л-PHK с использованием обратной транскриптазыс последующим привращеж ем в дн-ДНК, введения дн-ДНК в вектор, трансформации рекомбинантным вектором организма хозяина и получения клонов, субклонирования к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его главную часть из отобранных кло2 ной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли. ДНК плаз миды конструируют в результате культивирования человеческих иакрофагов с индуктором, отделения фракции, содержащей и-PHK человеческого ФНО, от индуцнрованных клеток, получения одн-ДНК из,и-РНК с использ ованием обратной транскриптазы с последующим превращением в дн-ДНК, введения дн-ДНК рВК 322, трансформации рекомбинантным вектором организма-хозяина и получения клонов субклонирования к ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО или его глацной части, из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную PHK pHTN 713.

10 табл, нов и выделяют рекомбинантную плазиидную ДНК, кодирующую челоьеческий

ФНО, Данные, иллюстрирующие предлагаемый способ, приведены в табл. 1-1, 1=2 2 1э 2 2 ° 3 10 °

Пример 1. Получают макрофаги

;человека. Полученные макрофаги высевают в чашку с плотностью клеток, равной приблизительно от 2 ° 10 ) до 1 10 клеток на 1 см и предварительно культивируют при 35»38ОС, предпочтительно при 37 (., в атмосфере 1007-ной.влажности, содержащей 5% двуокиси углеро- ( да, в течение приблизительно от 30 мин до 2 ч.

Затеи в качестве индуктора прибавляют эндотоксин, полученный из грамотрицательных бактерий, например ли1614 765 иополисахариц, полученный из Escheri—

chia coli; Pseudomonas aeruginosa или

Salmonella гуЬ1, а в качестве ингибитора синтеза белка прибавляют цикло5 гексимид. Культивирование продолжают еще в течение 3-8 ч для накопления и-PHK человеческого ФНО в макрофагах, Количество эндотоксина, как правило, равно около 1-100 мкг/мл. В качестве индуктора можно дополнительно прибавить форболовый сложный эфир, такой как форбол-12-миристат-13 — ацетат„ форбол-12, 13-дидеканоат или форбол-12,13-дибензоат в количестве прибли- 15 зительно 1-2000 нг/мл, Количество ингибитора синтеза белка варьируется в зависимости от его типа, Например,в случае циклогексимида оно равно

0,1-50 мкг/мл. В качестве культураль- 20 ной среды можно использовать различные культуральные среды, пригодные для культивирования клеток млекопитающих

;, (RPM1-1640, MEM — среду Eagle и модифи кацию Dulbecco MEM-среды). В предпоч- 25 тительном варианте в культуральную среду прибавляют сыворотку животных (такую как эмбриональная бычья сыво. ротка или сыворотка теленка) в количестве приблизительно 1-20_#_, 30

После культивирования экстрагируют общую РНК из клеток, а затем аффинной колоночной хроматографией на олиго(дТ)-целлюлозе или поли(У)-сафарозе-и отделяют фракцию, содержащую поли(А)

-и-РНК, Фракцию, обогащенную и-PHK человеческого ФНО, получают обработкой фракции поли(А)-и-РНК электрофорезом на кислотно-мочевинном агарозном геле или центрифугированием в гра- 0

40 диенте плотности са:.-арозы, Для подтверждения того, что получают фракцию и-РНК, кодирующую человеческий ФНО, и-РНК транслируют в белок и проверяют его биологическую активность. Вводят и-PHK в ооциты Xenopus

1aevis и анализируют цитотоксической активностью и ч Сго по отношению к мьппиным клеткам L транслированного белка.

Пример 2, Поли(Л1-и-РНК или обогащенную и-РНК Фракцию используют в качестве матрицы, а олиго(дТ) — в качестве затравки для синтеза одн-ДНК с использованием обратной транскрептазы

55 (например, полученной из вируса птичьего миелобластоза в присутствии дАТФ, дПТД, пГТп и дТТФ), Оид-ДНК используют в качестве матрицы и синтезир ззт дн-ДНК с использованием обратной транскрептазы или ДНК-полимеразы

Е.cali.

Результирующую дн-ДНК вводят в, плазмиду pBR 322, расщепленную Pst эндонуклеазой рестрикции. Результирующие рекомбинантные плазмиды вводят в клетку-хозяин, такую как Е,coli Х 1776у получают набор клонов к-ДНК путем отбора колоний, устойчивых к тетрациклину, Набор к-ДНК подвергают гибридизации с использованием Р-меченного фрагмента к-ДНК кроличьего ФНО, отбирают целевые клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, имеющие к-ДНКвставку, кодирующую полипептид человеческого ФНО, 92

P-Меченную к-ДНК синтезируют с использованием фракции поли(А)-и-РНК или фракции, обогащенной и-PHK человеческого ФНО, в качестве матрицы, Отдельно в качестве матрицы используют фракцию и-PHK полученную по аналогич ной методике, за исключением того, что в качестве сырья используют неиндуцированные макрофаги и синтезируют

9Z

P-меченную к-ДНК. В качестве индуцирующей отрицательной пробы используют P-меченную к-ДНК. Из указанного за выше набора к-ДНК отбирают клоны плазмид, сильно гибридиэующиеся с индукционной положительной пробой, но не гибридизующиеся с индукционной отрицательной пробой.

Описанную ниже операцию проводят для того, чтобы подтвердить то, что результирующие клоны содержат вставку к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, Плазмидную ДНК выделяют из вьппеуказанных клонов, превращают в однонитевую ДНК нагреванием или щелочной обработкой и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Фракцию и-РНК, содержащую и-PHK человеческого ФНО, добавляют к фильтрам для гибридизации с помощью фиксированной

ДНК. Выделенную и-РНК вводят в ооциты

Xenopus laevis для определения того, кодирует ли выделенная и-РНК полипептид человеческого ФНО.

Вышеуказанными способами получают трансформированные cHcтемы, имеющие рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагмент ДНК, имеющий иос; едовательность оснований, комилем.итарную и-РНК человеческо> о ФНИ.

Наличие гомологичности последовательностей оснований и установленных аминокислотных последовательностей человеческого ФНО и кроличьего ФНО указывает на то, что они филогенетически происходят из одного и того же гена, и свидетельствуют о том, что значи" тельная часть обычных участков представляет собой последовательность, необходимую для экспрессии биологической активности. Однако, как показано ниже, полный полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересе5

161ч76

Если полученные клонированные ДНК ,не содержат цельного участка, кодирующего полипептид человеческого ФНО, то отбирают к-ДНК большего размера

5 отбором иэ набора к-ДНК с использо. ванием в качестве пробы клонированных ФНО-фрагментов к-ДНК из трансформированных систем.

Клонированную к-ДНК, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность полипептида человеческого ФНО, анализируют путем определения последовательностей оснований некоторых фрагментов клонированной к-ДНК, обнаруживают последовательность оснований, гомологическую последовательность оснований к-ДНК кроличьего ФНО и отбирают те к-ДНК, которые содержат последовательность оснований, 20 соответствующую цельному кодирующему участку для полипептида человеческого

ФНО, Гомологичность между последовательностью оснований, кодирующей кроличий 25

ФНО, и последовательностью оснований, кодирующей полипептид человеческого

ФНО, а также гомологичность между установленными аминокислотными последовательностями полипептида кроличьего 30

ФНО и полипептида человеческого ФНО представлена, соответственно, в табл. 5 и 6.

Из этой гомологичности и из установленных N-концевых и С-концевых

35 аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО делают вывод о том, что к-ДНК человеческого

ФНО кодирует полипептид-предшественник ФНО, содержащий 233 аминокислотных остатка, а сам полипептид человеческого ФНО представляет собой полипептид, соответствующий 155 аминокисI нотным остаткам от карбокси-окончания предшественника. 45

5 6 кается с ФНО кроличьей плазмы, Это указывает на то, что полная аминокислотная последовательность полипептида человеческого ФНО не всегда необходима для экспрессии активности, частично модифициро1занный полипептид человеческогп ФНО также обладает активностью, поскольку он содержит активный центр полного полипептида ФНО, Пример 3. Модификацию ДНК проводят расщеплением ДНК подходящей эндонуклеазной рестрикции и отщеплением одного или больше кодона подходящими экэонуклеазами и/или эндонуклеазами, взятыми индивидуально или в сочетании, с последующим замещением на дегенеративные или другие кодоны, например на кодоны, синтезированные химически по фосфотриэфирному способу или отщеплением кодонов, Пример 4, Получение полипептида человеческого ФНО.

Плазмиду, кодирующую полипептид человеческого ФНО, получают введением клонированной к-ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО, в подходящий вектор. Можно испольэовать все векторы, пролиферирующие в трансформируемых микроорганизмах.

Плазмиду для получения неслитого полипептида конструируют связыванием фрагмента ДНК, содержащего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где иницииI рующий кодон АТС прибавлен к 5 -окончанию и стоп-кодон (ТАА TAG или

1

TGA) имеется в 3 -конце, с фрагментом ДНК, кодирующим промотор и последовательность Shine-Dalgarno. Плазмиду конструируют в результате введения фрагмента к-ДНК, имеющего последовательность оснований, кодирующую полипептид человеческого ФНО, где в

3 -конец добавлен обрывающий кодон, в вектор, в результате чего трансляционная считывающая структура соответствует структуре в структурном гене, Способ получения полипептида человеческого ФНО в форме слитого полипептида имеет преимущество, выражающееся в сведении к минимуму разложения продукта в трансФормированных клеткаххозяевах, Полный полипептид человеческого ФНО, соответствующий аминокислотной последовательности от серина в

82 положении до лейцина в 236 положении в верхних строчках табл, 6, не со7 1614765 8 держит метионина, Следовательно плазмида, сконструированная введением фрагмента к-ДНК человеческого ФНО, / связанного с 3 -окончанием последова5 тельности оснований структурного сливаемого гена через метиониновый кодаи (ATC), позволяет получить человеческий ФНО в виде слитого продукта способом расщепления метиониновой пептидной связи, например обработкой бромцианом..

Трансформированные организмы получают введением экспрессивного вектора В организм-хозяин,.такой KBK NHKpо . организм, например Е.coli. После это го культивированием трансформированных организмов получают полипептид человеческого ФНО или полипептид, содержащий метионин з N-окончании, Про20 дукт может накапливаться как в цитоплазме, так и в периплазме клеток-хозяев в зависимости от способа конструирования экспрессивного вектора, Дпя того, чтобы вызвать выделение полипеп-25 тида в периплазме, конструируют плазмиду с использованием гена, кодирующего секреторный белок, такой как ген щелочной Аосфатазы (phoA) или ген бел- . ка, связывающего фосфат (рпоБ), в ре- 30 зультате связывания ДНК, кодирующей полигептид человеческого ФНО,в правильной трансляционной считывающей структуре с указанным выше геном в подходящем месте после участка ДНК, 35 кодируошего сигнальный пептид.

Результирующие трансформированные организмы культивируют в подходящих условиях до полной выработки целевого полнпептида. После этого полипептид экстрагируют из культуры. После накопления выработавшегося полипептида г. ц . топлазме клетки-хозяева подвергают разрушению обработкой лизоцимом, замораживанием и размораживанием или 45 ультразвуковым диспергированием, либо с использованием пресса Френча, после чего центрифугируют или фильтруют и собирают экстракт, Полученный таким образом полипептид очищают обычными с.пособами очистки белков, например сочетанием высали.— вания, ультрафильтрации, диализа, ионнообменной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореэа, аффинной хроматографии и т,д, I

Описанным выше способом получают полипептид человеческого ФНО по изобретению и/или полипептид с метионином на N-конце полипептида.

11 р и м е р 5. Под модифицированными полипептидами человеческого ФНО подразумевают полипептиды, полученные из аллельных мутантов ДНК, кодирующей полипептид человеческого ФНО (аллельный мутантный полипептид), их получают в результате присоединения аминокислоты или пептида (состоящего иэ двух или более аминокислот) к Ы-окончанию или С-окончанию полипептида человеческого ФНО или аллельного мутантного полипептида, или в результате удаления одной или больше аминокислоты из голипептида чсловеческого ФНО, или аллельного мутантного полипептида (например, удаления 4 аминокислот из

N-окончания полипептида человеческого

ФНО), а также прои..водные, такие как сложные эфиры, ацильные производные или амиды кислот, образованные с использованием функциональной группы в молекуле, остатка амина в N-конце и.-..-; .карбоксильного остатка в С-конце, и их соли, образованные аминоостатками или карбоксильными остатками, например с гидроокисью натрия,гидроокисью калия, аргинином, кофеином, ппокаином, хлористоводородной кислотой, глюконо-.вой кислотой и т.п.

Модификацию полипептида человеческого ФНО или .его аллельного мутанfHQ

ro полипептида проводят по известным методикам,.

Химические и физико-химические ! свойства полипептида.

Молекулярный вес.

Молекулярный вес рЧ-ФНО измеряют

I гель-фильтрационным анализом на колон ке с TSK-гелем C 3000 SW в соответствии с жидкостной хроматографией высокого давления, используя 0,2 M фосфатный (рН 7) буфер с или без 8 М моченины и 0,57. 2-меркаптоэтанола в качестве растворителя. В качестве белков-маркеров молекулярного веса используют бычий сывороточный альбумин (ГИ 66000), кроличью триозефосфотизомеразу (MW 53000), яичный альбумин (MW 45000), свиной пепсин (MW 32700), соевый; чгибитор трипсина (МИ 20500), лошадиный миоглобин (MW 17800) и лошадиный цитохром-С (MW 12400).

В результате устанавливают, что рЧ-ФНО имеет мблекулярный вес 45000<

*5000 и 18000+3000 дальтон соответст1614765

10 венно в отсутствии и присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, к-ДНК, введенная в экспрессивную плазмиду pHTR 91, кодирует 155 аминокислотных остатков (за исключением метионина, происходящего из инициирующего кодона АТС), Из установленной аминокислотной последовательности рассчитывают молекулярный вес рЧ-ФНО (17097 дальтон), Рассчитанный молекулярный вес согласуется со значением, определенным в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола.

Этот факт указывает на то, что рЧ-ФНО присутствует в виде мономера (субъединицы) в присутствии мочевины и 2-меркаптоэтанола, но существует в виде агрегата, например в форме тримера, при отсутствии денатурирующих агентов.

Иэоэлектрическая точка, Изоэлектрическую точку определяют гель-электрофорезом с изоэлектрофокусированием при 3 Вт в течение 3 ч с 25 использованием пластинки 5 -ного полиакриламидного геля.и градиента рН от 4,0 до 6 5.

Белок окрашивают Кумасси бриллиантовым голубым. Отдельно гель нарезают 30 полосками 3 мм шириной и вымачивают ,в 20 мМ трис-HCl (рН 7,8) буфере для элюирования белка, Цитотоксическую активность четко наблюдают в элюате . из геля, вырезанного из места, соот35 ветствующего положению белка, определенному прокрашиванием.

Как было установлено, изоэлектрическая точка рЧ-ФНО равна 5,9+0,3, Аминокислотный состав., 40

Аминокислотый состав рЧ-ФНО определяют с помощью аминокислотного микроанализатора флуорометрическим способом с использованием ортофталевого альдегида после гидролиза образца хло45 ристоводородной кислотой.

50 мкг рЧ-ФНО гидролизуют в бн.НС1 при 110 С. Аминокислотный состав рассчитывают с корректированием на основе .значений, определенных в хая дом об- 0 раэце, гидролизованном 24,48 и 72 ч.

Цистин и цистеин определяют в виде цистеиновой кислоты, превращенной с помощью окисления пероксимуравьиной кислотой. Триптофан определяют по флуорометрическому способу, Результаты сведены в табл, 7, Аминокислотный состав хорошо согласуется с составом, рассчитанным из последовательности оснований, кодиру.— ющих полипептид человеческого ФНО.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

N-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют по методике разложения Эдмана.

Фенилтиогидчнтоинаминокислоту, получающуюся иэ N-концевой аминокислоты в способе разложения по Эдману, идентифицируют с помощью жидкостной хроматографии .высокого давления с использованием колонки (4,6x250 мм) с TSKгелем ODS 120А. Эти операции многократно воспроизводят для определения новых последовательно образующихся

N-концевых аминокислот.

Обнаруживают последовательно, что

N-концевая аминокислотная последовательность рЧ-ФНО является следующей:

NH -Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Ргой

-Ser-Asp

Некоторые полипептиды, получаемые в микроорганизмах при применении технологии рекомбинантной ДНК, имеют в своих N-концах остаток метионина, получающийся из инициирукнцего кодона (АТС) .

Определение С-концевой аминокислотной последовательности.

С-Концевую аминокислотную последовательность рЧ-ФНО определяют ферментативным способом с использованием карбоксипептидаз. рЧ-ФНО расщепляют карбоксипептидаЗой-А и карбоксипептидазой 7 при молярных соотношениях Фермента ксубстра-. ту равных соответственно 1 : 25 и

1 : 1000. Свободные аминокислоты, выделившиеся из С-окончания рЧ-ФНО в результате двойного отщепления, идентифицируют на аминокислотном микроанализаторе через соответствующие интервалы времени от 2 до 180 мин после расщепления.

Устанавливают, что С-концевая аминокислотная .последовательность рЧ-ФНО является следующей: — - - Tyr-Phe-Gly-Пе-Ile-Ala-Ieu«.

-СООН.

Разложение рЧ-ФНО трипсином.

500 мкг рЧ-ФНО разлагают с помощью

20 мкг ТРСК-обработанного трипс прикомнатной температуре в течение 5 ч.

1614765

Разложенный продукт подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель-электрофорезу. Белки окрашивают

Кумасси бриллиантовым голубым. В отдельном опыте гель нарезают полосками шириной 3 мм и нарезанный гель вы-* мачивают в 20 мМ трис-НС1 (pH 7,8) буфере для элюирования белка.

В результате устанавливают, что продукт разложения элюируемый из вырезанного геля, соответствующего зоне рН приблизительно на 0,3 более низко-го, чем изоэлектрическая точка рЧ-ФНО, обладает цитотоксической активностью.

В результате устанавливают, что частичная аминокислотная Iroследовательность продукта разложения является следующей;

N-концевая:-11Н -Thr-I ro-Бег Азр

С-концевая: - — Ile-Ala-Leu-COOkI.

Как показывает аминокислотная последовательность, продукт разложения представляет собой полипептид, получившийся в результате. отщепления четы-25

pez N-концевых аминокислот (Ser-Ser-Ser-Arg) от рЧ-ФНО, и обладает указаннсй выше цитотоксической активностью. Это означает, что по крайней мере четыре N-концевые аминокислоты в 30 э -!-ФНО не играют существенной роли в его биологической активности, Биологическая активность.

Цитотоксическая активность по отношению к мышиной клетке L-M.

Образец (О, 1 мл) серийно разводят указанной ниже средой и по 0,1 мл суспензии мышиных клеток 1.-II (100000 клеток на 1 мл) добавляют в кажцую лунку многолуночной пластинки.

Используют минимальную питательную среду Easelâ, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки,, Пластинку инкубируют при 37 С в течение 48 ч в поло, алостью влажной атмосфере, содержащей 45

5 углекислого газа. Ilocne инкубирования прибавляют 20 мкл 25 -ного глутаральдегида для фиксирования жизнеспособных клеток. После фиксирования пластинку промывают и сушат, После этого для окрашивания фиксирован- ных клеток прибавляют О, 1 мл 0,05 ного раствора метиленового голубого.

Избыток метиленового голубого отмывают и пластинки сушат. Метиленовый голу5» бой, связавшийся с фиксированными клетками, элюируют 200 мкл О, 36 н, НС1 н измеряют его поглощение при

665 нм. Поглощение пропорционально числу жизнеспособных клеток. Концентрацию биологической активности, требующуюся для умерщвления 50% клеток

T.-M, определяют как 1 ед./мл. Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-If, определенную в указанных выше условиях, выражают как единицы (LM) для того, чтобы отличать от цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929 как клеткам-мишеням.

Определяют содержание белка.

В результ; те устав-вливают, что рЧ-ФНО имеет удель ную активность

Ф равную 2 10 единиц (И1) и более на

1 мг белка.

Противоопухолевос действие на саркому Meth А, трансплантированную мышам.

Противоопухолевое действие на мышей с саркомой Meth А оценивают следующим образом.

Marrrax BALB/G MaccoH около 23 r внутрикожно трансплантируют 200000 клеток саркомы Meth А в кожу брюшины и через 7 дней отбирают мышей, у которых опухоль имела 6"7 мм в диаметре. На седьмой день после трансплантации опухоли рЧ-ФНО вводят в массу опухоли или внутривенно.. Содержание эндотоксина в рецептуре рЧ-ФНО меньше

У чем 0,01 нг на 1-10 единиц (LM) цитотоксической актив ности.

Устанавливают, что при введении в массу опухоли некроз опухолевого трансплантата наблюдается у всех мышей, которым ввели рЧ-ФНО в дозах 1 ° 10

3 ° 10э и1 ° 10+: единиц (LM) на мышь в течение 24 ч после инъекции, и опухоль полностью регрессирует в размере 3/5, 5/5 и 5/5 соответственно при каждой указанной выше дозе. При внутривенном введении некроз наблюдают у всех мышей, получивших инъекцию рЧ-ФНО в дозе 3 10 и 1 ° 10 единиц (LM) на мышь, и доля полной регрессии составляет соответственно 3/5 и 4/5, Ингибирующее действие рЧ-ФНО а рост клеток опухоли человека in vitro.

Ингибирующее действие рЧ-ФНО на рост клеток опухоли человека и нормальных клеток оценивают in vitro в следующих условиях. Клетки опухоли человека или нормальные клетки высеивают в количестве 10000 клеток на лунку в 1 мл минимальной питательной среды Еад1е, содержащей 101 эмбриональной бычьей сыворотки, с использо13

1614765

Таблица Х-I (5!)-ТСА ССТ ТСТ ССС ССС СТС ЛОТ САС ЛАС

ССТ CTA GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA

GAG

CGT ССС AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG

AAG СТС ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG

GCC GAC GGG CTG TAC СТС ATC TAC TCC CAG

GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC

TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC hGC CGC

TTC GCC GTC ТСС TAC CCG AAC AAG GTC AAC

СТС CTC TCT GCC ATC AAG AGC ССС TGC CAC

CGG GAG ACC ССС GAG GAG GCT GAG ССС ATG

GCC TGG TAC GAG ССС ATC TAC CTG GGC ССС

GTC TTC САС TTG GAG AAG GGT GAC CGG СТС

AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT СЛ6 TAC CTG

GAC СТТ GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC ТТТ

GGG ATC ATT GCC CTG-(Э 1.)

Таблица Х-2

Arg Ala Leu Ser Asp Lys

Чаl Чаl А1а Asn Pro Gln

Ser Ala Ser

Pro

Lqu Ala His

Glu Gly Gln

Ala Asn Ala

Уаl

Leu Gln Trp Leu Ser Gln Arg

Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys

Asn Gln Leu Ча1 Val Pro Ala

Leu Thr Asp

Asp Gly Leu

Туг-Ьеи Ile Tyr Ser Gln Val ванием пластинки с 24 лунками, Добавляют рЧ-ФНО в результирующей концентрации 100 единиц (T.M)/мл и затем культивируют при 37ОС в течение 4 дней в полностью влажной атмосфере, содержащей 5Х двуокиси углерода, За 4 дня до окончания культивирования в каждую лунку прибавляют 1 мкл Н-тимидина.

После культивирования клетки промыва- 10 ют фосфатным солевым буфером и лизируют с помощью О 5Х-ного додецилсуль3 фата натрия, Количество Н-тимидина, введенное в клетки, определяют, измеряя радиоактивность лизата. 15

Ингибирующее действие в виде доли ингибирования роста, рассчитываемой по следующему уравнению:

Доля ингибирования роста (Х) (а — Ь)(а ° 100), где а и Ь представ 0 ляют собой радиоактивность, введен-. ную в клетки соответственно при отсутствии рЧ-ФНО и в присутствии рЧ-ФНО, I

Результаты, сведенные в табл. 8, показывают, что рЧ-ФНО существенно ингибирует рост клеток опухоли человека, но не влияет на нормальные клетки, Это наблюдение показывает, что рЧ-ФНО селективно атакует опухолевые клетки.

Иммунологические свойства, Раствор рЧ-ФНО (100 единиц (LM)/мп) смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего ФНО. После инкубирования при 37 С в течение 2 ч измеряют цитотоксическую активность реакционной смеси.

Продолжение таблицы 1-2

Gln

His

Gly

Thr

Phe

Ser

Leu

Gly Cys Arg

Thr Val Ser

Tyr

Ser

Phe

Ala

Asn Lys Val

Ser Pro Cys

Ala Glv Pro

Val

Tyr

Ile

Glu

Ser

Ala

Pro

Pro

Lys

Glu

Аяп

Ьеи

Ser

His

Arg

Gl u

Thr

Al a

Met

Glu

Val

Pro

ТГД

Phe

Tyr

Gln

Glu

Asn

Ser

Ьеи чу

Lys

Gln

The Glu

Asp

С3,, Gly

phe

Glu Ser

А2а .Leu

Leu

Х1е

Il e

Таблица 2-Х (5 )-AGC ACT GAG AGT ЬТС ATC CGG GAC GTC

GAG СТС GCG GAG GGG CCG СТС ССС AAG AAG

GCA GgG GGG ССС CAG GGC ТСС AAG CGC TGC

СТС ТОС СТС ЛСС СТС ТТС ТСТ ТТС СТО СТС

GTG GCT GGA .ССС ACC ACG Стс ТТС TGC CTG

TTC

GTG ATC GGC ССТ CAG

AGG

GAG

CCA ААС AAC CTC CAT

CAG ТСС

GAG

CTA

GCC CAG ATG GTC ACC

GTC

CCT

GTG

СТС

TCT CGG ССС CTG AGT GAC AAG

GCC

CAC

GTA GTA GCA AAC CCG

CCT CTA

СТС CAG TGG CTG AGC CAG

GGC

CAG

AAC

ССС CTG CTG GCC AAC GGC ATG

GCG

GAC

AAC CAG CTG GTG GTG

CCG

ACG

CTC

CAG

TAC CTC ATC TAC TCC

GCC GAC

CTG

TCC

АСС GGT CAA GGC TGC CGC

ТТС

CTC

CGC

CTC ACT CAC ACT GTC AGC

ТАС GTG

СТС

TAC CCG AAC AAG GTC

GCC

TTC

ATC AAG AGC ССС TGC

CAC

TCT

CTC

ACC ССС GAG GAG GCT GAG CCC

TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC

CAG ТТС GAG AAG GGT GAC CGG

GAG GTC AAC CAG ССТ GAG TAC

GCC GAG TCC GGG CAU GTC TAC

ATT GCC CTG-(3 ) GCC

TGG

GTC

TTC

AGC

GAC

АСС

CTT

ATC

GGG

Tyr Бeu Gly

G2y Asp Arg

Pro Glu Tyr

Gln Val Туг

ATG

GGC

СТС

CTG

TTT!

Таблица 2-2

Ile Arg Asp Val Glu

Leu Pro Lys Lys Л1а

$ег Lys Arg Cys Ьеа

Ser Phe Leu Leu Val

1(:1а 763

$er Thr Glu Зег Net

Leu Ala

Leu

Ala Thr Thr Leu Phe

Cys Leu

Gln Glu

Arg Чаl Пе Gly Pro

$er Pro Asn Asn Leu

Glu

Glu Gln

His Leu Чаl

Asn Pio Чаl Ala Gln Net Чаl Thr Leu

Arg

Pro

Lel3 Яег

Ala Asn

Ser Ala

Leu Ala

Ser Arg Ala

His Val Val

Asp E ys

Pro G1n

Val

Яег Gln

Glu Gly

А1а Asn

G3n Leu Gln

Ala Leu Leu

Trp Leu

Ala Asn

Сlу Het

Val Pro

Leu Val

Leu Thr

Asp Gly

Leu Phe

Ser Gln Чаl

Туг

Phe

Val Leu

Ala Val

Asn Lys

Ser Pro

Leu

Cys His

Leu Ser

СХи Thr

Arg

Ala

Ala Glu Pro Het

Trp туг

Phe.Gln

Gly Gly Ual

Arg Leu Ser

Tyr Leu Asp

Glu Ser Gly

Ala Leu

Gln Val Tyr Phe Gly

° а ° o s

Табдщр 3

aeII 40 50 60

1 1 l

ATGAGCACTGAQAGTATGATCCGGGAC

TACTCG ZGACTCTCATACTAGGCCCTG

10 20! 1

GQGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAQAGA

CCCCCCCCCCCCCCCGGGAGACCTCTCT

70 80 90 100 110 120

1 В 1 t I 1

GTCG AGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAGAAGGCAGGGGGGCCCCA GGCTCCA

CAGCTCGACCGCCTCCCCGGCGAGGGGTTCTTCCGTCCCCCGGGGGTCÑCGÀGGT

НаеХ

130 140 150 160 170 180

1 1 t Ф t I

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTGCTCGTGGCTGGAGCCACCАСССТСТТСТСС

АСССАСЛСССЛСТСССЛСЛАСАСАААССЛССЛССАСССЛССТСССТССТСССАСААСАСЯ

G1y Gly

Cys Leu

Иа Gly

His Phe

Thr Glu

Leu Ala

Xle Ile

Glu Gly Pro

Pro Gln Gly

$ег Leu Phe

Asp Asn Gln

Leu Tyr Leu

Ser Gly Gln

Leu Thr His

Ser Tyr Pro

Ala Ile Lys

Pro Glu Glu

Glu Pro Ile

Ьео Glu Lys

Ual Asn Gln

I1e Туг

Gly Cys

Thr Val

Тук Leu

Gly Asp

Pro Glu

Arg Ser

Ser Arg

Val Asn

Arg

Ьуа

Ala

1б14765 20

ПРололжение табл.3

190 200 210 220 230 240

t ! !

CTGCTQCACTTCAQGGTGATCGGCCCTCAGGAGGAAGAGCAGTCCCCАААСААССТССАТ

QACGACGTGAAGTCCCACTAGCCGGGAGTCCTCCTTCTCGTCAGGGGÒÒÒGÒÒGQÀGGÒÀ

250 260 270 280 90 300 ! ! !

CTAQTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACCCTCAGATCAGCTT CCCTGAGTGAC, GATCAGTTGGGACACCGGGTCTACCAGTGGGAGTCTAGTCGAA GGGACTCACT4

310 320 330 340 350 360

t ! !

AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCGCAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTQAGC

TTCGGAGATCGGGTGCATCATCGTTTGGGCGTTCACCTCCCGGTCGЛООТСАССОАСТСО

370 .380 390 400 410 420 ! t ! ° )

CAGCGTGCGAACG CCCTGCTGGCCAACGGCATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG

QTCG CACQCTTGCGGGACGACCQGTTGCCGTACTTCGAGTGCCTGTTGGTCGACCACCAC

430 440 450 460 470 . 480

t Р t

CCQQCCQACGGQCTQTACCTCATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAQCGGТСААООСТОССОС

QGCCQQCTQCCCQACATGQAGTAQATGAGGGTCCAAGAGAAGTCGCCAGÒÒÑÑGAÑGGÑG

490 500 510 520 530 540 ! t t t

TCCTACQTGCTCCTCACTCACACTGTCAGCCGCTTCQCCGTCTCCTAСССОАЛСААООТС

AQGATQCACQAQGAGTGAGTGTGACAGTCGGCGAAGCQQCAGAGGATОООСТТОТТССАО

550 560 570 580 ! t t

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCACCGGGAGACC

ТТООАООАОАОАСООТАОТТСТСООООАСООТООСССТСТОО

590 600

t !

GAGGCTGAGCCC

CTCCGACTCGGQ

610 620 630 640 650 660 ! ! !

ATGGCCTQGTACGAGCCCATCTACCTGGGCGGCGTCTTCCAGTTGGAОAAGGGTGACCGG

TACCGGACCATGCTCGGGTAGATGGACCCGCCGCAGAAGGTCAACCTÑÒTÑÑÑÀÑÒGGCÑ

670 680 690 700 710 720 ! t ° ., t t

CTCAGCACCG AGGTCAACCAGCCTGAGTACCTGQACCTTGCCQAQTCCGGGCAGGTCTAC

GAQTCGTGQCTCCAGTTGGTCGGACYCATGGACCTGGAACGGCTQAGОCCCGTCCAGATG

730 . 740 750 760 770 780 !

t ! !

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGACCACCACTCCTCCCCCTСТСССЛССССАОС

AAACCCTAGTAACQGGACACTCCCCTGACTGQTGGTQAGGAQGGGGAGÀGGGÒQGGGÒCG

790 800

t t

CCCCTCACTCTGQQCG CC! TCAG

QQQGAGTGAQACCCGCGGGAQTC

21

22

Таблица 4

GACCCACGG

-30 -20 -10 -1! I I 1

CTCCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC

1 10 20 . 30

1 I 1

ATG AGCACTGAAAG CATG ATCCG G GACG TG

HetSerThrGluSerHetIleArgAspVal

40 50 60

t I

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG

- 6luLeuAlaG1uGluAlaLeuProLysLys

70 . 80 90

1 1

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGC6GTGC

ThгС1уС1уProGlïG1óSåгЛг1ЗArgCys

100 110 120

Ф 1 I

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC

LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle

130 140 150

1 1 t

СТСССЛССССССЛССАСС СТСТТСТСССТС

ValAlaGlyAlaThiThrLeuPheCysLeu

160 170 180

I 1 1

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG

LeuHisPheGlyValIle6lyPro6lnArg

190 200 210

1 1 1

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC

GluGluPheProArgAspLeuSerLeulle

220 230 240

1 1 1

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGA CATCT

SerProLeuAlaGGlnA1aVa1Arg еrSeг

250 260 270

1 1 1

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC

SerArgThrProSerAspLysProVa1Ala

280 290 300

1 1 I

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAG6GG, HisValValAlaAsnProGlnA1a6luQly

310 320 330

1 I

CAGCTCCAGT6GCTGAACCG CCGG6CCÀAÒ

GlnLeuGlnÒr pLeuAsnAгgЛгдА1аAsn

340 350 360

I 1 I

GCCCTCCTGGCCAATG6CGTG6AGCT6AGA

А1 аЬеоЬеиЛ1аЛап61уЧа LGluLeuArg

24

Продолжение табл.4

370 300 390

1 I 1

QATAACGAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC

AspAsnGl nLeuValVa1Pr oSe r Gl uGly 400 410 420

1 1 I

CTQTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC

LeQTryЬецI1eТуrSeгСlnValLeuPhe

430 440 450

I 1 I

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG

ЬувС1уС1nGlyCysProSerThrHisVal

460 470 480

1 1 1

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC

LeuLeuTbrHisThrIleSerArgI1eAla

490 500 510

1 1 I

СТСТССТАССАСАССААССТСААССТССТС

ValSeгТугС1пТпrLysValAsnLeuLeu

520 530 540

1 I 1

TCTGCCATCAAGAGCCCCrGCCAGAGGGAG

SerAlaI1eLysSerProCysGlnArgGlu

550 560 570

1 1 1

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG

ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp

580 590 600

I 1 1.

TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC

ТугС1оРгоХ1еТугЬeuGlyGlyValPhe

610 620 . 630

1 1 I

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT

GlnLeuG1uLysGlyAspArgLeuSerAla

640 650 660

t 1 1

GAGATCAATCGGCCCG ACTATCTCGACTTT

С1и 11еАБпАгуРгоЛярТугЬeu As pPhe.

670 680 690

1 r 1

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC

A1aGluSerGlyG1nValTyrPheGlyIle

00 710 720

t 1 1

ATTGCCCTGrGAGGAGGACGAACATCCAAC

11еА1а):

730 740

1 1

СТТССС АААССССТССССТСС

26

1614765

Таблица 5 бО сслс

GGAG

120 тест с

150

180

CgGCACTI TGATCGGCC A Gg

CTGCACT TGATCGGCC "Л

-GAAGA — СС GG:iCÑÒ CT ! 240

С СС GGCCCA — — — С

С С CCC GGCCCA KTGGTC С

270 и — с—

ЯОС С фА6ТОАСААО

300

330 с лссц gC

ЗбО

ЗС -,CCC

G 1

390 лссх с! 614765

Проползание табл.5

TGTACCTCATCTACTCCCAG

TGTACCTCATCTACTCCCAG

450.

Ятс ) accg

QTCAGC отслас

510

CG CGCCGTCTCCTACC CgEC AAGGTC

CG CGCCGTCTCCTAC E) AAGGTC

540

KACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

570

gcc

APAGGGGGCT(AG3PC

CPAGGAGGCTGAG C

600

TGG С

Г - Стаат „.А

630

GGAGAAGGGTGACCGA

GGAGAAGGGTGACCGG

TCAG А ГС (3QGC GE TP C

660

690

А Т ГТассалатаМСССАьСТСТАС й(С ГТСССОА07 фСССАЖТСТлС

TTTGGGATCATTGСССТСТС

TTTGGGATCATTGCCCTGTG

П р и м е ч а н и е, Верхние строчки: последовательность оснований, кодирующая человеческий ФНОпредшественник, Нижние строчки: последовательность оснований, кодирующая кроличий ФНО-предшестве .ник, Области, заключенные в прямоугольник, являются гомологичным участком.

Обозначение "- †" показывает удаление кодона, Обозначение "хкк" показывает обрывающий кодон.

29 зо

Таблица 6

161ч765

Ile Arg Asp Val

1 мя и 1

Glu А1а

Gly Pro

Glu Ье

С1и Ье

Se Arg rg Cys

Se Lys ги Сув

Thr

Ala

Le Phe

Ье Cys

Ile

Ееи

60

Gly

Arg

Arg

Glu

lu Gl. --- Phe r Arg Asp eg Ser eu

1и С1г Gln See ed, Asn Лвп Led His .еи

Е1е Ser (Ргс Leu la Gl --- --- Ala Val

Val Asn Pr Val la Gl Met Val Thr Leu

rg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys г вег Ala Яег Лг I Ala Ьеи (Бег Лвр Ьув

100

Pro Ча1

Pro Leu

110

Asn Arg

Ser Gln

Ala

Val

120

Val

Met

130

Glu eu Arg

Lys eu Thr

eu Va

eu Val Val Pro

16! 4765 32

Процоп,кение табл.6

x Leu !Хе Туг Бег Gln r Leu Ile Т г Ser Gln

Ser Glu

А1а Asp

?.уз РТу Gln Gly Cys Pro (Бег)

Бег 1у Gln Бу СУs Arg (Вес)

Xle Гег

Val Ser

170 ту7 Gln Thr,ys Va тД Pro Asn а Val

180

Thr His м ягойr

Arg !le

Аг Phe

Asn Keu I eu Зег Ala

Asn Eeu Leu Ser Ala

Glul Gly lа Glu Ala

G lu Glu la Gl Pro

200

Gln

His

Lys Pro

Met Ala

:Pro Ile Tyr Leu Gly

Pro Х1е Т г Leu Gl

210

Gly Ча Phe Gln Leu 61и Lys Gly Asp Arg ll Р у Я1

220 . Leu Ser Ala flu Пе Бп1 Arg (Рго Asp Tyr

Leu Бег Thr lu Val psn Gln Щ Glu T r !

Г ° 230

ГейЛяЯ Phe Ala Glu Бег Gly Gln Val Туг

Ьеи As Ьеи Ala Glu Бег Gl Gln Val Т г

Phe G1y Ile !1е Ala Ье

Phe Gl Ile Ile Ala Ье

П р и м е ч а н и е. Верхние строчки: предшественник человеческого фНО, Нижние строчки: предшественник кроличьего фНО.

Участки, обведенные прямоугольником, являются гомологичным участком.

Обозначение " †-" показывает удаление аминокислоты, 33

Аминокислота Относительные молярные количества

Таблица 8

Доля ингибирования роста, Х

Клетки человека

Нормальные клетки:

WI-38 !

t (АТСС CCL 75) легочный диплоид (ATCC «CCL 171) легочный диплоид (ATCC ССЬ 186) легочный диплонд

Не ингибирует

Не ингибирует

Не .ингибирует

MRC-5

IMR-90

Опухолевые клетки:

G-361

НТ-1376 (АТСС СЫ 1424) меланома (АТСС СИ 1472) кар цинома мочевого пузыря (АТСС СИ 1500) кар цинома молочной железы (АТСС СШ 1543) остеогенная саркома (АТСС CCL 218) аденокарци,нома толстой кишки

f(АТСС НТВ 22) аденокарцинома молочной железы (АТСС CRL 1440) почечная лейомибластома (ATCC CRL 1469) эпителоидная карцинома (АТСС CCL 2) эпителоидная карцинома

49

ZR-75-1

H0S

WiDr

MCF 7

С-402

59

HeLà

Asp-Asn

Thr

Ser

Glu+Gln

Pro

Gly

Ala

Cys

Val

Met

Ile

Leu

Tyr

Phe

His

Ly s

Arg

Trp

Таблица 7, 12,1

5,5

12,4

20,3

10,3

10,6

13,0

1,5

12,1

0,1

8,0

17в7

6,8

3,9

2,8

6,1

7,5

1,6

5 1614 765 . 36

Таблица 9

10 20 30! 1 ) ССССССООСССССООСССТСТССАСАСАСС

40 50 60

) I I

GCCATGAGCACTGAGhGTATGATCCGGGAC

HetSerThrGluSerMetI1eArgAsp

70 80 90

СТССАССТСССОСАООООССССТССССААС

Ча1С1иЬеиА1аС1иО1уРгоЬеиРгоЬуз.

100 110 120

1 1 ) AAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGC

LysAl aGlyGl уProGl ïGlóSåгLysAr g

130 140 150

) I I

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTG

CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu

160 170 180

l I t

CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC

LeuV a1Al aGly Al àÒh r Th r LeuPheCys

190 200 210

I Ф 1

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG

LeuLeu Hi s PheAr gVa1 I 1 eGly Pr oGl n

220 230 240

I 1

GAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT

С1иС1иС1иС1пЯегРгоАзпАзпЬеиН18

250 260 270:

I 1 ) CTAGTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACC

LeuValAsnProValAlaGlnMetValThr

280 290 300

I ) I

CTCAGATCAGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC

LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp

310 320 330

) I I AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG

LysРгоЬеиАlaHi зЧа17а1А1аАвпРго

340 350 360

1 ) ) CAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC

G1nVa1GluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer

370 380 390

I I 1

САссстсссААссссстОстсссс .AcGGc

Gl nAгдА1а AsnAl аЬеиЬеиАlaAsnGló

37

38

16! ч 65

1

400 410 420

1 9 4 °

ATGhAGCYCACGGACRhCChGCTGGTGGTG.

MetLysLeuThrAspAsnGlnL

430 440 450

s еCCGGCCGACGGGCTGThCCTChTCThCTCC

ProAlaAspGlyLeuÒórLåаI1å TyrSer

460 470 480 е t I

CAGGTTCTCTTCAQCGGTCAhGGCTGCCGC

GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg

490 500 510

I t I

TCCTACGTGCTCCTCACTCAChCTGTCAGC

SerTy rVa1LeuLeuThr Hi sThrValSer

520 530 540

Ф 1 t

CGCTTCGCCGTCTCCTACCCG AACMGGTC йгдРЬеИ.аЧа1$егТугРгойаиЬуьЧа1

550, 560 570 ! I 1

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTQC

ЛйпЬенЬеи$егЛ1а11еЬузБегРгоСуз

580 590 600 ю Ф

CACCGGGRGACCCCCGRGGAGGCTGRGCCC

HisArgGluThrProGluG1 uAlaGluPro

610 620 630

I I I

ATGQCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGC

NetAlaTrpTyrGluProI1eTyrLeuGly.

640 650 660 е 1 I

GGCGTCTTCCAGTTGGAGAhGGGTGACCGG

GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg

670 680 . 690

9 1 I

CTCAGCACCGAGQTCAACCAG CCTGAGTAC

Ьеи8егТЬгС1иЧа1ЛзпС1вРгоС1иТуг

700 710 720

В t I

CTGGACCTTQCCQAGTCCGGGCAGGTCTAC

Leu AspLeuAlaQl uSe r GlyGl nValTy r

730 740 750

° . Ф

TTTGGGATCATTQCCCTGTGAGGGQACTGA

PheGlyllelleAlaLeu

760 770 . 780

9 1 1

CCACCACTCCTCCCCCTCTCÑCACÑÑCAGC

790 800

1 1

CCCCTCACTCTGQGCG CCCTCAG

39

161476

Получение и-РНК ФНО иэ человеческих альвеолярных макрофагов, Человеческие альвеолярные макрофаги собирают бронхо-альвеолярным промы5 ванием с помощью фосфатного солевого буфера. Альвеолярные макрофаги, 6,3 10 клеток, суспендируют в среде

RFMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток 9 ° 10 клеток на чаш6 ку. Их предварительно культивируют при 370С в полнос