Способ иммобилизации алкогольоксидазы

Способ иммобилизации алкогольоксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая используется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах. Цель изобретения - повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы. Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включения в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану - ядерный фильтр, в гелевую структуру дополнительно вводят азид натрия в концентрации 0,25-500 мМ, а иммобилизацию проводят при PH 8,0-9,0. 1 ил. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4429758/30-13 (22) 23.05.88 (46) 23.12.90. Бюл ° № 47 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Ю,Ю. Кулис, M.В. Песлякене, Л.С.Матялене и В.-С.А.Лауринавичюс (53) 577. 15 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1326978, кл. G 01 N 27/46, 1985.

Авторское свидетельство СССР № 1125249, кл. С 12 N 11/08, 1982. (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ (57) Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а имен. но к технологии получения иммобилизоИзобретение относится к способам иммобилизации ферментов, а именно к технологии получения иммобилизованной алкогольоксидазы, которая используется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах.

Цель изобретения — повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксицазы, Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы из

Candida buidinii путем включения фермента в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану — ядерный фильтр, b в гелевую структуру дополнительно

„.Я0„„1615179 А 3 (1) С 12 N 11/08 // G 01 N 27/40

2 ванной алкогольоксидазы, которая ис пользуется в анализаторах для определения этилового спирта в крови и других биологических растворах, Цель изобретения — повышение активности и стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы.Способ заключается в том, что при иммобилизации алкогольоксидазы путем включения в гелевую структуру,содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующего нанесения его на лавсановую мембрану — ядерный фильтр в гелевую структуру дополнительно вводят азиц натрия концентрации 0,25500 ммоль, а иммобилизацию проводят при рН 8,0-9,0, 1 ил. 3 табл. вводят азид натрия в концентрации

0.25 — 500 ммоль, а иммобилизацию про- . водят при рИ 8,0-9,0.

Азиц натрия комплексируется в активном центре алкогольоксидазы, Это подтверждает изменение в спектре поглощения алкогольоксицазы в.присутствии азида натрия в области 400700 нм.

На чертеже показаны спектры поглощения алкогольоксидазы в отсутствие (кривая А) и в присутствие (кривая Б) азида натрия, Пример 1. 3 0 ед. алкогольоксидазы из Candida buidinii> 8 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,1 мл 0,01 M фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,1 М

1615179

КС1 1 мМ ЭДТА и 50 ммоль азида нат.рия, В раствор добавляют 0,02 мл 5Хного глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают и выпивают на мфкропористую лавсановую мембрану (ядерный фильтр) проницаемостью 10,7, дйаметром пор 0,54 мкм, площадью

9 см . Для получения ферментной мембраны, применяемой в анализаторах для 10 определения этилового спирта, на по в< рхность приготовленной двухслойной мембраны надевают ацетатцеллюпозную мембрану толщиной 10 мкм, П6лученную трехслойную мембрану помещают в хо- 15 лфцильник в течение суток, затем разрезают на куски, надевают на электрод и, тщательно отмыв струей буфера, определяют ток ферментного электроца п1 и рН 8,0 при 0,6 В отн. Ag/AgC1 20

ss)ектрода сравнения.

Аналогично проводят иммобилизацию а когольоксицазы с использованием азида натрия в концентрациях IOO и

5()0 ммоль или в отсутствии азида нат- 25 рйя по известному способу, Готовят аналогичные примеру 1 ферментные электр оды.

В табл. 1 приведены сравнительные параметры полученных электродов. Изме-30 р ния проводят в 0;01 M фосфатном,буф ре (0,1 М КС1, 1 мМ ЭДТА), рН8,0, И з приведенных в табл, 1 данных в дно, что при тех же концентрациях этанола ток или чувствительность элек-35 т1 одов, содержащих иммобилизованные мембраны, изготовленные согласно предл; гаемому способу (2-4), значительно вЦше, чем содержащих мембрану, приго-, тс вленную согласно известному спо- 40 сс бу.

Мембраны, изготовленные согласно известному способу, обладают низкой чт вствительностью и непригодны для использования в анализаторах этанола., 45 пОскольку при определении в реальных мйогокомпонеHTHbIx средах соотношение фонового и полезного сигнал:ов превышает 5Х из-за наличия в них посторонних веществ, 5Î

Пример 2. Для выяснения интервалов используемых концентраций азица натрия аналогично примеру I проводят иммобилизацию алкогольоксидазы без нанесения ферментного раствора на ядерный фильтр с использованием

55 азида натрия в гелевой структуре в различных концентрациях, В этих иммобилизованных препаратах при

-0,6 В отн. Ag/AgC1 электрода сравнения определяют алкогольоксидазную активность в Е/г. Вычисляют остаточную ферментативную активность (7) по сравнению с неиммобилизованным препаратом, Измерения проводят в 0,01 М фосфатном буфере, рН 8,0 (1,0 М КС1, 1 мМ ЭДТА) в присутствии 10 мМ этилового спирта.

Полученные данные приведены в табл, 2.

Данные, приведенные в табл,2, показывают, что при концентрациях азида натрия 0,25-500 ммоль активность иммобилизованной алкогольоксидазы увеличивается в 1,5-40 раз по сравнению с ферментным препаратом, приготовленным без азида натрия, При концентрации азида натрия более 500 ммоль активность уже не увеличивается. Кроме того, увеличивать концентрацию нецелесообразно, так как гель при больших концентрациях азида натрия становится менее жестким, а следовательно, ухудшаются механические свойства получаемых ферментных мембран, При эксплуатации менее жесткой ферментной мембраны фермент начинает вымываться из геля, Таким образом, оптимальные концентрации азида натрия при изготовлении ферментной алкогольоксидазной мембраны 0,25-500 ммоль.

Активность иммобилизованной алкогольоксидазы зависит от рН буферного раствора, в котором проводятся измерения. При наличии в буферном растворе, 10 мМ этилового спирта и используя

9 ферментную мембрану, приготовленную по примеру 1 с .азидом натрия в гелевой структуре 100 ммоль, при рН 6,0 ток электрода равен 12 нА, при рН

7,0 — 22 нА, при рН 7,5 — 27 нА, при рН 8,0 — 32,5 нА, при рН 8,5

35 нА, при рН 9,0 — 32,5 нА, при 10—

20 нА, Таким образом, наилучшие результаты реализации способа получе- ны в буферных растворах рН 8,0-9,0.

Пример 3; Для определения стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы изготавливают ферментную мембрану с использованием азида .натрия концентрации 500 ммоль и по известному способу по примеру 1 и определяют зависимость тока электрода от продолжительности эксплуатации.

Полученные результаты приведены в табл,3 (концентрация этилового

Та блица 1

Количество я9ила натрия ° ммоль

JIltOTXt2CT9 тОКа эЛЕКтропа, мКА/смз, При коНЦЕНтРачии этилового спирта, 9е! т-- — -тт

5 10 15 20 ЗО 40 50 70

Известнъо! способ

0,047 0,070 0,107

0,0!7 O,0ЗЗ

o,!зз

O,17З о,г!З

Прецлагаеммн способ

0,066

0,166

0,699

0,669 0,866

1,698 . 1,998

6 ° 726 6,625

500

o,!çç

О, 336

1,395

0,!97 0,270

0,5!О 0,666

1,998 2,664

0,406

0,982

4,029

0,540

1,339

5,395

Т а б л н ц а 2

Активность

ИММОбипн9О ванной алкоголаоксицазм, Еlг

0,051 0 057 0,063 0,070 0,30 0,72 1 06 1 00 0,93

0,027 0,0З9, Остаточнал активность

42ермента, Х

0,9 1 ° 3! ° 7

2,1 З, 5 10 24 36 ЗЗ 31

1,9

Таблицаз

Способ Зависимость тока электрола, нА, от процолинтеланостн эксплуатацющВ Стт

12 14 .16

0 2 6 )! 6 (В 120 ) 22 1 20 22 24 126 26 1 20 йрацлагаае!

42 41 41 . 42 42 39 37 35 . 32,5 30 29 27 25 23 22 20

0 0 0

0 0

0 0 0 0

1,0 09 07. 05 0,2 0,1 0!

7 р н м е ч а н н е. Кояцентрацнв азмца натрия 500 ммоль.

1 6151 спирта в ячейке 0,5 мМ, другие условия аналогичны примерам 1, 2) .

Электроды, содержащие мембраны, работают в среднем по 8 ч сут при комнатных условиях. Остальное время суток ферментные мембраны хранятся в буферном растворе при комнатных условиях.

Иэ табл.3 видно, что чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилиэованной алкогольоксидаэы по предлагаемому способу, в течение 1 мес эксплуатации уменьшается на 50Х тогда как мембрана, приготовленная по иэвестному способу, Концентрация азица яат- -I .T t"

79 6 о полностью теряет активность в течение 10 дней.

Формула иэобретения

Способ иммобилиэации алкогольоксидаэы, включающий введение алкогольоксидаэы из Candida boidinii в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегид в буферном растворе, и последующее нанесение на ядерный фильтр, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности, в гелевую структуру дополнительно вводят аэид натрия в концентрации

0,25-500 ммоль, а иммобилиэацию проводят при рН 8,0-9,0.

1615179

fg !

06

02

Юо Не Составитель А.Семенов

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор A. Обру ар ч

Заказ 3961 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæroðoä, ул. Гагарина,101