Способ проведения гибридизационного анализа

Способ проведения гибридизационного анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к способам проведения гибридизационного анализа, и может быть использовано ДАЯ поиска, идентификации и детекции уникальных последовательностей в нуклеиновых кислотах. Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и упрощение способа. Способ проведен , л гибридизационного анализа включает иммобилизацию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране и гибридизацию ее со специфическим зондом, несущим биоспецифический лиганд. Образовавшиеся гибриды детектируют с помощью коньюгата окрашенных латекстных частиц,содержащих 0,001-0,5 мзс.% красителя, с лигандсвязывающим белком. С помощью предлагаемого способа можно проводить множественный гибридизационный анализ нуклеиновых кислот ,1 з.п.ф-лы.

СОЮЗ COBETCKv;X

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4652161/13 (22) 20.02 89 (46) 15.01,91. Бюл. М 2 (71) Институт биоорганической химии им, M.M.Øåìÿêèíà и Научный центр по разработке и внедрению современных методов молекулярной диагностики (72) С,Н.Щербо, Ю.В.Лукин, Т.И.Венер, M.Ô.Tóð÷èHñêèé, В.Д. Кнорре, В.П.Зубов, В.А.Коваленко, Е.Д.Свердлов и С,И.Туркин (53) 575.224.2(088.8) (56) ЕР М 0267521, кл. С 12 Q 1/68, 03.11.87. (54) СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения гибридизационного анализа, и может быть

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам проведения гибридизационного анализа, и может быть использованодля поиска, идентификации и детекции различных нуклеотидных последовательностей в нуклеиновых кислотах.

Цель изобретения — повышение чувствительности анализа и упрощение способа его проведения.

Способ проведения гибридиэационного анализа включает иммобилизацию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране, гибридизацию ее со специфическим- зондом, несущим биоспецифический лиганд (метку), и детекцию образовавшихся гибридов с помощью коньюгата окрашенных латексных частиц, содержащих 0,001 — 0,5 мас.% красителя. с лигандсвяэывающим белком.,, Ы,, 1628938 А1 (я)5 G 01 N 33/543,С 12 Q 1/68 испсльзовано для поиска, идентификации и детекции уникальных последовательностей в нуклеиновых кислотах. Целью изобретения является повышение чувствительности анализа и упрощение способа, Способ проведен..л гибридизационного анализа включает иммобилизацию исследуемой нуклеиновой кислоты на синтетической мембране и гибридизацию ее со специфическим зондом, несущим биоспецифический лиганд. Образовавшиеся гибриды детектируют с помощью коньюгата окрашенных латекстных частиц, содержащих 0,001 — 0,5 мас.% красителя, с лигандсвязывающим белком. С помощью предлагаемого способа можно проводить множественный гибридизационный анализ нуклеиновых кислот,1 з.п.ф-лы.

Нуклеиновая кислота при иммобилизации на пористой синтетической основе адсорбируется как на поверхности мембраны, так и в ее порах (особенно для нейлоновых мембран), При проведении детекции с помощью ДН К-зондов, связанных с молекулами красителя или с коллиодным золотом, последние попадают в поры мембраны и там связываются с определяемыми нуклеиновыми кислотами, При реализации предлагаемого способа для проведения гибридизационного анализа используют коньюгат латексных частиц с лигандсвязы,вающимбелком с размерами частиц 0,2—

5 мкм, которые не проникают в поры мембраны. Несмотря на зто сохраняется стабильность образовавшихся гибридов и повышается чувствительность анализа.

При использовании в качестве окрашивающего агента латексныx частиц, содержащих менее 0,001 мас., красителя, образовавшиеся гибриды прокрашиваются слабо и чувствительность анализа снижается. Использование латексных частиц, содержащих более 0,5 мас.g красителя, привсдит к потере стабильности конъюгата, что обусловливает появление более высокого фона, сопоставимоГО с сиГналом.

Способ более эффективен, так как позволяет проводить множественный гибридизационный анализ, т.е. Одновременну о детекцию нескольких гибридов, Для этого перед проведением гибридизации проводят мечение нескольких зондов нуклеиновых кислот индивидуальными биоспецифическими лигандами (биотином, гаптенами, антигенами), которые Вводят В гибридизацию одновременно. После завершения гибридизации и отмывки от избытков зондов в раствор одновременно вводят коньюгаты латексов с соотвегствующими лигандсвязывающими белками (стрептавидином, ферментом, антителами). Одновременное использование па данному способу нескольких . окрашенных латексов, несущих флуоресцирующие в различных областях спектра краслтели, дает возможность визуально или с использованием УФ-ламп и оптическлх фильтров, а также спектрофлуориметров проводить анализ одновременно нескольких участков исследуемой нуклеиновай кислоты за счет одновременной идентификации нескольких образовавшихся гибридов, Пример 1. а) Приготовленле коньюгата латекса, содержащего пиронлн Ж со стрептавидином, К 1 мл 5% — ной суспензии полиакролеинавого (ПА) латекса в 0,1 M ФСБ, рН 7,2, наполненного красителем пиронин Ж (0,1%), с размерами частиц 4,8 мкм добавляют

250 мкг стрептавидина в 2 мл того же буфера.Смесь выдерживают 3 ч при комнат— ной температуре, Полученный конъюгат трижды промывают на центрифуге 0,1 М

ФСБ, рН 7,2, содержащим 0,57 овальбумина, редиспергируют в том же буфере да

0,1%-ной концентрации и хранят при 4 С, б) Иммобилизация ДНК на нейлоновым фильтр.

0,1 мл раствора ДНК фага л, в воде (5 мкг/мл) денатурируют в течение 5 мин при 100 С, быстро охлаждают во льду и готовят GGpMO разВед8ний, уменьшая конц8нтрацию ДНК при каждом разведении в 5 раз. По 1 мкл полученных растворов ДНК наносят на нейлоновый фильтр, который предварительно вымочен в течение 30 мин

В 0,4 M трис-НО-буфере с рН 7,5, а аатем высушен на воздухе, В количествах 1 нг.

200 пг,40 пг,B пг, 1,6 пг. Площадь пятна с иммобилизован ной ДНК составляет 4 мм .

2 в) Мечение ДНК-зонда биотином, 0,1 мл раствора ДНК фаг=" л, в Воде

5,(1 мг/мл) инкубируют при 95 С в течение

10 млн, После зтога к раствору ДНК добавляют 200 мкл раствора, содержащего 1,6 M бисульфит натрил и 3,6 M зтилендиамин, доведенный до рР 7,5 уксусной кислотол и

":0 прогретого при 95"С в течение 10 мин.

Смесь инкубируют при 95 С 30 мин, после чего eecI раствор Ч 3 vr I орерж"щ л ЦНК наносят на колонку и ДНК отделяю. гельфлльтрацией на сефадексе 6-50 (Supe.Ôn8), 15 используя для зл оции 0,1 M натрийбаратный буфер, рН 8,5. К фракциям, содержащим ДНК (объемам 0,7 мл), добавляют

100 мкл pacTBGpa М-аксисукци нимиднОГО эфира В диметилфармамиде (концентрация

20 50 мкмоль/мл) и инкубируют в течение 10 ч, От избытка биатлнилируюгцего агента ДНК отделяют на колонке, содержащей сефадекс

0-50 (Зорегг1пе) В 0,15 М йаС1. Раствор биотин -.èpoâaHHoé ДНК хранят при -20 С, 25 г) Гибридизация, Нейлоновые фильт >ы с нанесенной на них . !НК переносят a .ашки Петри с 3 мл предгибридизационного раствора(1 мл на

1 см2), содержащего (Hà 10 мл) 2 мл воды, 30 5 мл формамида, 1 мл 10%-ного додецилсульфата натрия (ДСН), 2 мл 59%-ного декстрансульфата, 0,5 мл M трис-НС1, рН 7,5, v, 0,58 г йаС1. Инкубируют 10 мин при 42 С.

Зате14 добавляют 120 MKr (из расчета

35 40 мкг/мл) ДНК спермы лосося л 0,6 мкг био-инилированной ДНК (из расчета

0,2 мкг/мл), которые предварительно денатуриру(от 10 мин при 1000С. Гибридизацию ведут при 42 С В течение 16 ч при

40 постоянном перемешивании, По окончании гибридизации фильтры отмывают два раза по 5 мин раствором (3 мл), содержащим

0,3 M MaCl и 0,4 М цитрат натрия, при комнатной температуре, два раза по 30 мин в.

45 3 мл раствора, содержащего 0,3 M ИаС1, 0,04 M цитрат натрия и 10 „-ный ДСН, при 420С, два

pa a no 10 мин pacYBGpot4, содержащим

ОЯ15 M МВС1 и 0,002 М цитрат натрия, прл кОмнатной темп8ратуре.

50 После отмывки фильтр можно либо хранить, либо сразу использовать для детекция, д) д8текция образовавшегося г!гибрида . ДНК.

55 . Отмытые фильтоы вымачлвают - растворе, содержащем 0,1 М трис-НО, рН 7,5;

0,1 M г1аС1, 0,,05%-ный тритон Х-100 (TST) и

1 4-ный желатин, в течение,0 мин, Затем В указанный раствоо добавляют суспензию конъюгата лятексл, H- =noIIH8HHoro пирони1620938 ном К, из расчета 0,01< на 1 мл раствора.

Через 20 мин после начала иикубации иа качалке при комнатной температуре наблюдают появление окрашенных (при видимом свете обиаружлвается 200 г:Г,QHK) и флуоресцирующих при УФ-облуче;-ии (365 нм1, пятен. -Наибсльшяя чувствительность достигается через 1 ч инкубацил и составляет

1,6 nI или 0,4 пг/мм .

Пример 2. а) Приготовление каньюГата лагекса, содержащего флуоресцеии сс

cтр8п I я f÷идиHoм, К 1 мл 5;ь-ной суспензии ПА-латекса в

0,1 M ФСБ, рН 7,4, окрашенного красителем флуоресцеии (0,5 ), с размером частиц

0,20 мкм добавляют 350 мкг стрептав:..;диня в 2 мл того же буфера. Далее процесс. Ведут аналогично описанному B Itpèìåðe 1, б) Иммобилизация ДНК иа нитроцеллюлозном фильтре.

Ни-роцеллюлозиые фильтры г редварительно вымачивают 2 мин в воде и зятем

10 MNH в pacTBQpe, содержащем 0,9 NaCi ll

0,12 гл цитрат натрия, ПодгoToBI

Нитроцеллюлоэлые фильтры с нанесенной на них ДНК переносят в чашки Петри с предгибридлзационным раствором На 1 ч В буфере, содержашем 1 мл раствора Денхардта (состав, г, фикол 5.; поливииилпирролидон 5; бычий сывороточныл альбумин (БСА)

5; вода до 500 мл), 1 мл раствора, содержащего 3 M NaС1, 0,2 M ЭДТА, воду, 0,6 М трис-НО, доведенный HCI до рН 8,0, 50 мкл

10$-ного ДСЛ, 3 мл воды, 15 мкл дрожжевой т-РНК (концентрация 10 мгlмл) ия 5 мл раствора. Затем добавляют 0,6 мкг биотинилированной ДНК (из расчета 0,2 мкг/мл), которук предварительно денатурируют

I0 мин при 100 С, к раствору, содержащему

На 5 мл 2,5 мл формамида, 0,2 мл расТВора

Денхардта, 1 мл раствора, содержащего 3 M

NaCl, 0,2 M ЭД А, воду, ОЯ M трис-НС1, доведенный НО до рН 8,0, 15 мкл дрожжевой --РНК, 1,235 мл яодь., 50 мкл 10,7-ного

ДСН. Гибоидизяци.о проводят 3 ч. По окончании гибридизации фильтры отмывают аналогично примеру 1. д) Детекция обоаэовавшегося гибрида

ДН К

Отмытые нитроцеллюлозные фильтры вымачивают в 3 мл раствора TST и 1,(-ного желатина в течение 15 мин. Затем в указанный раствор добавляют суспензию коиью

Гата лат< кса, содер>кд щего 0,03",ь

Затем В указанный рг твср добавляют сус30 пензию,<оньюгата латекса, окрашенного

55 флуоресцеина иэ расчета 0,1 на 1 мл раствора. Через 20 мии после начала иику ации иа качалке при комнатной температуре иабл одается появлеч«e о:;рашеиных (при

Видимом сеете обнару

4 пг ДНК (1 lir/м.л ь

П р и м 6 р 3, Я) Приготовление KCHûàгата латекса, содержащего акридиновый ора» жевый с яВидином.

К 1 <л 5",4-ной суспочзии ПА=латекся в

О 05 M Ф .Б, рН 7,2, содержал,его краситель акридииовь и орячжевый в количестве

":,ОО . $, с раэ:, ерог ча" тиц 1,2 мкм добавляю —; 300 м

Дале", процесс веду-: аиалс»ично примеру 1. б) 4ммобилизаци=. ДНК ня нейлоновом фильтре — как в примере 1. в) Меченые ДHI;-aoHäa биотином — как В

ПРИМBРЕ г) Г,, -ридизя H!: — как B прлмере i. р Детекция обГ-"..аовавшеегося гибрида

ДН К.

Отмыть 8 ч йлоновые фильтры вымачивают в 3 мл растворе TST с 1;4-иым жела <ином и IO -ной сяхароэой в течение 10 мин. акридииовым оранжевым с авидином иэ расчета 0,001 ф, иа 1 мл рас;вора. Через

30 мин после качала про аления иа качалке прл комнатной температуре наблюдается появление окрашенных (при видимом. свете обнаружено 0,2 нг ДНК) и флуоресцирующих при УФ-обл .внии пятен. Наибольшую чувствительность получают через 4 ч после начала иикубации. она составляет 4 пг или I пг/мм .

<рормула изобретения

",. Способ проведения гибридизационного анализа, включающий иммобилизацию исследуемой иуклеиновой кислоты иа синтетичес.<ой мембране, гибридизацию нуклеиновой кислоты со специфическим зондом, несущим биоспецифически1 лигяид, и визуализацию образовавшихся гибридов с помощью коиъюгата окрашивающего агента с лигаидсвяэывающим белком,отличающийся тем, что, с целью повыш8иия чувствлтельности анализа и упрощения способа его проведения, в качестве окрашиваю цего агента используют латексиые-частицы, содержащие 0,001-0,5 мяс.,4красителя;

2. Способ ro и. 1. отличающийся тем, что, с целью повь<шеиия зфф8ктиВности c eT обеспече-".-<ИH Boa fo®HocTH одно Вре1620938

Составитель Е.Кузнецова

Техред М.Моргентал Корректор M,Ñàìáoðñêàÿ

Редактор А.Огар Заказ 4243 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 менного анализа нескольких участков ис— следуемой нуклеиновой кислоты, последнюю гибридизуют одновременно с несколькими специфическими зондами, несущими биоспецифические лиганды, а визу- 5 ализацию образовавшихся гибридов проводят при обработке суспензией. содержащей несколько конъюгатов различно окрашенных латексов с соответствующими лигандсвязывающими белками,