Вектор pps-5-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих

Вектор pps-5-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к генетической инженерии . Целью изобретения является конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих , а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор pPS-5-neo размером 10,6 т.п.о., емкостью до 7,0 т.п.о., имеет уникальные спиты рестрикции HindllI, Sail, BamHI и EcoRI для клонирования чужеродных гонов под контроль промотора питомоз тловируса (CMV) а клонирование генов с собственным промотором осу цествлястся по сайту Clal. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и метатрексату, а клеток Е.со- li - к канамнцниу и ампициллину. О с

СОЮЗ СОЕЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК цц С 1? N 15/79

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО И306РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4649319/ 1 3 (22) 30. 12.88 (46) 23.01.91. Бюл. h" 3 (71) Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта и Институт биооргани еской химии им. М.М.1Яемякина (72) F..È.Ôpîëîsà, И.С.Павлова, М.Л.Маркелов, П.М.Чумаков и В.С.Прасол в (53) 575.2?4.g 577.2(088.81 (56) Williams D.A. et аl Гхр. Med, 1987, v.6, t." 7, р.2053-?060. (54) ВЕКТОР рр$-5-МО ЛЛЯ ВВГЛЕНИЯ И

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КУЛЬТИВИРУНП4Х

СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАИ111ИХ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Иелью изобретения является

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, представляет интерес для различного рода научных исследований, в частности для изучения разного рода факторов дифференцировки и пролиферации, а также для получения линий клеток — продуцентов практически ценных белков, Цель изобретения — конструирование вектора, позволяющего достигнуть высоких уровней экспрессии чужеродных генов s клетках млекопитающих, а также Обеспечивающего простые и удобные способы введения генов в состав вектора.

Вектор на,основе ретровирусного вектора PPS-4-пео, обеспечивающий введение и экспрессию чужеродных генов в клетках млекопитающих. Кроме

„„SU„„1622396 А 1

2 конструирование вектора, позволяющего

pocòигнуть вьк:оких уровней экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитавi щих, а также обеспечивающего простые способы клонирования генов в состав вектора. Вектор РРВ-5-пео размером

10,6 т.п.о., емкостью до 7,0 т.п.о имеет уникальные cai Ты рестрикции

HindIII Sall BamHI u FcoRI для клонирования чужеродных гснов под контроль промоторл нитомезз: овируса (CHV) а клонирование генов с собстяеншпч промотором осуществляется по сайту

C1al. Вектор обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и метатроксату, д клеток Е.со- с ф

li — к канамицину и ампициллину. того, общим свойством всех прототипных векторов является отсутствие

Фе полилинкерной области. (3

В состав вектора рР$-5-пео вводят силыилй конститутивный промотор цито— мегаловирус» и инахтивации одног

Ретрояирусный вектор рРЯ-5-пео характеризу .тся следую; ими свойст— вамй. Размер вектора околс 10,5 т.п.n., фатазой встраиваемо i j(HK около 7 т.п.о.

Вектор состоит из: линейной формн векторной плазь.иды р$Р64, у полилинкер заменен единичным сайтом

EcoRI плазми Ia содержит ген устойчивости к ампициллину, двух фрагментов провирусв лейкоза мьпяей Молони, включзюгшх левый и правый I,TR, область (, ответственную за упаковку

1622396 полных транскриптов ретровирусной конструкции в вирусоподобные частицы, а также прилегающие к I;TR участки клеточной ДНК, двух участков начала репликации вируса SV40, содержащих также ранний промстор вируса; гена пео, определяющего устойчивость клеток млекопитающих к генетицину и Е.coli к канамицину; сигнала для сплайсинга иэ ранней области вируса БЧ40, гена дигидрофолатредуктазы мьппи, обеспечивающего устойчивость к метатрексату,сильного конститутивного промотора цитомегалловируса; полинкера, содержащего уникальные сайты рестрикции

Sa1I, HindIII, BamHI и EcoRI, по которым производится встраивание чужеродных генов под контроль промотора цитомегалловируса. 20

Конструирование ретровирусного вектора pPS-5-пео приницпиально состоит в следующем. В вектор рРБ-4-neo вводят сильный конститутивный промотор цитомегалловируса с одновремен- 25 ной инактивацией одного иэ двух сайтов SalI в полилинкерной области.

Введение чужеродных генов в клетки млекопитающих с помощью вектора

1 рРБ-5-пео осуществляют в два этапа.

1. ДНК, вектора pPS-5-пео с встроенным в него геном вводят методом

ДНК-трансфекции в клетки, экспрессирующие структурные белки вируса лейкоза мьппей (клетки (2 или подобные).

2. После селекции клеток, экспрессирующих ретровирусный конструкт, на среде с генетицином производят сбор вирусоподобных частиц из среды культивирования клеток и заражают клет- 40 ки, в которых предполагается проводить экспрессию чужеродного гена.

Для повышения уровня экспрессии гена в клетках используется амплификация вирусного материала в клетке на сре- 45 де с метатрексатом, Наработка ДНК вектора pPS-5-пео производится в клетках F..coli.

Пример 1.Конструирование ретровирусного вектора pPS-5-пес ДНК вектора

S0

pPS-4-пео подвергают неполному гидролизу SalI так,чтобы расщепился только один из двух присутствующих в плазмиде сайтов, липкие концы достраивают фрагментом Кленова ДИК-полимеразы 1 в

5 присутствии всех четырех ИМАТР, расщепляют Hindlll, дефосфорилируют АосI фатазой из тимуса теленка, очищают электрофорезом в легкоплавкой агарсзе и лигируют со специально обработанным промотором цитомегалловируса.

Для получения промотора цитомегаллоI вируса (СИЧ) вначале проводят модификацию сайтов в плазМиде рВС12СИ7.

Плазмиду переводят в линейную форму и лигируют в присутствии синтетического линкера, содержащего сайт рестоиктазы Баl?. Полученную плазмиду

pBC12 CMV-Ба1? гидролиэуют SalI, обрабатывают фрагментом Кленова

ДНК-полимеразы I в присутствии четырех dNTP, расщепляют l1indlll и очищают .600 п.н. фрагмент, содержащий промотор CHV, электрофореэом в легкоплавкой агарозе. Фрагмент лигнруют в вектор рРБ-4-пео, подготовленный следующим образом: ДНК обрабатывают SaII при условии частичного гидролиза и фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTP, затем

HindIII и фосфатазой. Лигирование промотора СИ7 в вектор pPS-4 -neo дает искомый вектор pPS-5-пео.

Пример ?. Экспрессия гена

1-интерферона человека в клетках

Rat-I.

С помощью вектора pPS-5-пес дости" гают эффективной экспрессии гена

f-интерферона человека в клетках

RatI, составляющей 1000 ед./мл в сутки. увеличение уровня экспрессии генов, клонированных в векторе рРБ-5-пео, достигается за счет увеличения,дозы гена в клетках при их культивировании на среде с метатрексатом.

Формула изобретения

Вектор pPS-5-пео для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих размером 10,6 т.п.о., содержащий плазмидную ДНК pPS-4-пео-размером

10 т.п.о. и мол.м. 6,6 Nd, у кото рой крайний участок узнавания рестриктазы SalI в полилинкере закуплен, StuI-HindIII — фрагмент плаэмидной

ДНК рВС12 CNV размером 0,6 т.п.о. и мол.м. 0,4 Мд с конститутивным промотором иитомегаловируса, у которого затуилен участок узнавания рестриктаэ StuI, генетические маркеры: пео — определяющий устойчивость клеток млекопитающих к генетнцину (G 418), а клеток Escherichia coli к канамицину, DFRT — обеспечива кЮй

Составитель С.Бандурин

Техред Л.Олийнык . Корректор С.П!екмар

Редактор Н.Яцола

Заказ 88 Тирам Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, I"35, Раувская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина, 101

5 1622 устойчивость к метятрексяту, Ар — обеспечивяющий устойчивость к ямпициллину; уникальные сяйты рястрикции Hindlll, BamHI, SalI, EcoRI, В рШ, Clal, RotI, емкость вектора—

5 до 7 т.п.о., ястряивяние чужеродных генов под контроль промоторя цито396 6 миаловируся по сайтям HindIII, SalI, BamHI и ЕcoRI, а чужеродных генов с собственным промотором по сайту

ClaI, спектр хояяев: фиброблясты мыши (К1НЗТЗ, Ва1Ь/с), фиброблясты крысы (Ratl и Rat2), клетки обезьяны — Coal.