Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток

Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицинской и микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 и упрощение способа. Способ включает разрушение биомассы клеток на френч-прессе, экстракцию бактериальных белков буфером, содержащим 2 М и 4 М мочевину, растворении осадка рекомбинантного интерлейкина-2 в 2%-ном растворе додещшсульфоната натрия, хроматографию на Сефадексе G-100, хроматографию на лизоцим-сефарозе и хроматографию на сервацеле. Выход рекомбинантного интерлейкина-2 человека составляет 50-55%. с S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК цв <и>

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPGK0MV СВИДЕТЕЛЬ :ТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ П<НТ СССР (21) 4463983/13 (22) 21.07 ° 88 (46) 23,01.91. Бюл. В 3 (71). Институт органического синтеза

АН ЛатвССР (72) Ю.П.Бундулис, М.Р.Бука, И.К.Звйргзда, А.Р.1(иманис и Э.Я.Грен (53) 612. 017,. 1: 616-006. О. 52 (088. 8) (56) Патент С1г1А 11- 4604377, кл. 514/8, 1986, (54) СПОСОБ ВЬ1ДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

КЛЕТОК (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения рекомбинантного интерлейкина-2 из биомассы бактериальньгх клеток, содержащих ген интерлейкина-2 челове.— ка в составе рекомбинантной плазмидной ДНК, и может найти применение в медицинской и микробиологической промышленности.

Цель изобретения — повышеггие выхода интерлейкина-2 и упрощение способа.

Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 (рИЛ-2) заключается в следующем, Биомассу F..coli RR1/ðÀÑ 262-33 (ВКПМ) суспендируют в 50 ммоль трисНС1 {рН 8,5), содержащем 5 ммоль питиотрейтола (ДТТ), 1 ммоль фенипметилсульфонилфторида, фильтруют через марлевый фильтр, клетки бактерий разрушают на френч-прсcc e (5))5 С 12 Р 21/00, С 1? N 15/00 нологии и может найти применение в медицинской и микробиологической промьппленности. Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина-2 и упрощение способа. Способ

° включает разрушение биомассы клеток на френч-прессе, экстракцию бактериальных белков буфером, содержащим

2 М и 4 М мочевину, растворении осадка рекомбинантного интерлейкина-2 в

27.-ном растворе pодецилсульфоната натрия, хроматографию на Сефадексе

G-100, хроматографию на лизоцим-сефарозе и хроматографию на сервацеле, Выход рекомбинантного интерлейкина-2 человека составляет 50-557-. (700 атм) . Осадок отделяют центрифугированием и промывают в следующей последовательности: сначала 50 ммоль трис-НС1 (рН 8,5), 5 ммоль ДТТ, 1 ммоль ЭДТА (буфер А), затем этим же буфером, содержащим 2 М и 4 М моче- 0 вину. Осадок отделяют центрифугирова- N

° . нием и растворяют в присутствии 27.ного додецилсульфата натрия. Полученный раствор фракционируют на Се- (g, фадексе G-100. Фракции, содержащие Q рИЛ-2, диллизуют против буфера А.

Раствор рИЛ-? наносят на колонку с иммобилизованным лизоцимом, уравновешенную буфером А, промывают ее тем же б.фером, содержащим 0,17, додецилсульфата натрия, при этом элюируют несвязавшиеся примесные бактеpHRSEE,Hhlp белки. рИЛ-2 элюируют буферным раствором А, содержащим

0,57, попепилсульфата натрия.

1622398

Далее следует стадия ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сервацеле, с которой рИЛ-2 элюируют линейным градиентом 0-1,5 M NaC1 в буфере А. рИЛ-2 выходиФ с колонки при концент- рации КаС1 0,8 И.

Пример 1. 150 r клеток E.co1i RR1/ðÀÑ 262-33, содержащих рИЛ-2 в виде нерастворимых тел включения, суспендируют в 600 мл буферного раствора А, гомогениэируют на френчпрессе при давлении 700 атм. Полученную суспенэию центрифугируют 30 мин при 12000 об./мин на центрифуге. Оса- 1g док ресуспенднруют и по 3-4 раза промывают сначала буфером А с последующим цеитрифугированием в описанном режиме, затем буфером А, содержащим

2М мочевину, и буфером А, содержащим

4 M мочевину, Осадок суспендируют в

40 мл буфера А, содержащего 27 додецилсульфата натрия, при перемещивании растворяют, прогревают 2 мин при о

60 С, охлаждают до комнатной темпе- 25 ратуры и тестируют иммунохимическим или биологическим методом.

Раствор рИЛ-2 наносят на колонку

2ч К 100/100 с сефадексом С-100, уравновешенную 50 ммоль трис-НС1 (рН 8,5) с добавками 5 ммоль ДТТ, 1 ммоль фенилметилсульфонилфторида и 17. додецилсульфат натрия. Фракции, содержащие рИЛ-2, объединяют и диализуют против буфера Л. Выход рИЛ-2 составляет 807,.

Отдиализованный раствор с концентрацией 3-4 10 MF./ìë наносят на колон6, ку К 50/30 с иммобилизованным лизоцимом, приготовленным следующим обра- 40 эом, CNBr -активированную сефароэу 4В замачивают в 1 ммоль НС1 и суспендируют в 0,1 М растворе бикарбоната натрия, после чего к сорбенту добавляют раствор лизоцима. Иммобилизацшо проводят в течение 12 ч при 4 С. Концентрация лизоцима при этом состапляет

5 мг/мл сорбента. Сорбент отмывают AT несвязавшегося лиэоцима сначала 0,1 М 0 раствором бикарбоиата натрия, а затем 0,1 M раствором lltpTBTR натрия.

Сорбцию рИЛ-2 проводят из 50 ммоль трис-НС1 (рН 8, 5), далее колонку промывают тем же буфером, содержащим

0,17 додецилсульфата натрия. Элюирование рИЛ-2 проводят раствором

50 ммоль трис-НС1 (рН 8,5), содержащим 0,57 додецилсульфата натрия. Элюирование продукта контролируют спектрофотометрически и иммуноферментным методом анализа. Выход рИЛ-2 на этой стадии составляет 80-907.

Раствор рИЛ-2, полученный после аффинной хроматографии иа колонке с иммобилизованным лизоцимом, разбавляют буфером А в 10 раз и наносят на колонку с ДЕЛЕ-сервацеллом (колонка K

50/100), промывают буфером А. Элюирование рИЛ-2 осуществляют градиентом

0-1,5 M хлористого натрия в том же буфере. Выход рИЛ-2 составляет 50-557,.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход целевого продукта до 50-557, и упростить способ em получения, при этом степень очистки в расчете на удельную активность интерлейкина-2 составляет 3,0 10 MF./ìã.

Формула изобретения

Способ выделения рекомбинантного интерлейкина-2 из бактериальных клеток путем разрушения клеток, экстракции белков раствором мочевины, растворения полученного осадка в растворе, содержащем додецилсульфат натрия, гель-хроматографии растворенных белков и последующей очистки целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию белков проводят последовательно в растворах 2 М и 4 М мочевины, осадок растворяют в буфере А, содержащем 50 ммоль трис-НСТ (рН 8,5), 5 ммоль дитиотрейтола,1 ммоль фенилметилсульфонилфторида,2Ж додецилсульфата натрия, а очистку целевого продукта проводят сорбцией белков на колонке с лизоцим-сефарозой в растворе

50 ммоль трис-НС1 (рН 8,5) и элюцией целевого продукта тем же раствором, содержащим 0,57 додецилсульфат натрия, а затеи сорбпией белков в буфере А на колонке с ДЕАЕ -сервацеллом и элюцией градиентом 0,0-1,5 М хлористого натрия н буфере A.