Способ получения препарата для кормления жвачных животных

Способ получения препарата для кормления жвачных животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в животноводстве для кормления животных. Цель изобретения - повышение продуктивности. Для этого в качестве биологически активного ингредиента в препарате используют штамм Prapionlbacterium sp. HNCMB № 00287 или штамм Veilonella sp. HNCMB fsfe 00288 или штамм Blfldobacterlum sp. HNCMB . N 00289. Штаммы получают следующим образом: бактерии изолируют из отобранной из рубца пробы и исследуют способность отдельных изолятов к биосинтезу летучих жирных кислот. На дополненной соответствующим кормом (сено, овес, меласса) содержащей рубцовую жидкость комплексной питательной среде при анаэробных условиях выращивают полученные изоляты. Затем с помощью газохроматографического анализа определяют концентрацию уксусной, пропионовой и масляной кислот в культуре. Изоляты, продуцирующие указанные органические кислоты в предпочтительном соотношении , генетически маркируют. Далее исследуют их размножение в рубце жвачных животных. Полученные таким образом штаммы способны длительное время (не менее 60 дней) размножаться в рубце жвачных и поддерживать соотношение уксусной и пропионовой кислот в области (1,5-4,0): 1, Полученные культуры микроорганизмов сами по себе или смешанные с используемыми в животноводстве носителями, разбавителями и/или консервантами и/или с другими обычно вводимыми жвачным животным веществами формулируют в оральный препарат. 9 табл. (Л ю ел Сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s А 23 К 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 3946999/13 (22) 15.08.85 (31) 3084/84 (32) 15.08.84 (33} HU (46) 30.01.91. Бюл. № 4 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (HU) (72) Иштван Отт, Шандор Сентмихальи, Янош Шереши, Тибор Ланг, Янош Дохи, Имре Моравчик и Дьердь Ботонд Кишш (Н0) (53} 636.087.8(088.8) (56) Патент Австралии № 489367, кл. 34.2, 1979. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ДЛЯ КОРМЛЕНИЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в животноводстве для кормления животных, Цель изобретения — повышение продуктивности. Для этого в качестве биологически активного ингредиента в препарате используют штамм

Prapionibacterlum sp. HNCMB М 00287 или штамм Veilonella sp. HNCMB Ы 00288 или штамм Blfldobacterlum sp. HNCMB. № 00289. Штаммы получают следующим обИзобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано в животноводстве для кормления животных.

Целью изобретения является повышение продуктивности.

Цель достигается тем, что получают препарат, способный изменять соотношение уксусной и пропионовой кислот s желудочном соке рубца жвачных животных в интер„>5U<„> 1625317 АЗ разом: бактерии изолируют из отобранной иэ рубца пробы и исследуют способность отдельных изолятов к биосинтеэу летучих жирных кислот. На дополненной соответствующим кормом(сено, овес, меласса) содержащей рубцовую жидкость комплексной

"питательной среде при анаэробных условиях выращивают полученные иэоляты. Затем с помощью газохроматографического анализа определяют концентрацию уксусной, пропионовой и масляной кислот в культуре.

Иэоляты, продуцирующие указанные opf àнические кислоты в предпочтительном соотношении, генетически маркируют. Далее исследуют их размножение в рубце жвачных животных. Полученные таким образом штаммы способны длительное время (не ф менее 60 дней) размножаться в рубце жвачных и поддерживать соотношение уксусной и пропионовой кислот в области (1,5 — 4,0):1, Полученные культуры микроорганизмов сами по себе или смешанные с используе- Я мыми в животноводстве носителями, разбавителями и/или консервантами и/или с юв другими обычно вводимыми жвачным животным веществами формулируют в оральный препарат. 9 табл. вале (1,5-4,0):1. При этом в качестве биологически активного ингредиента в препарате используют штамм Propionibacterlum

sp. HNCMB ¹ 00287 или штамм VeiloneПа sp. НКСМВ № 00288, или штамм

В0!боЬастегйт sp. HNCMB №00289. Штаммы Propionibacterium зр., ЧеИопеИа sp., Blfidobacterium sp. выделены из рубца жвачных животных, селектированы по способности к биосинтеэу летучих жирных кис1625317

0,1

2,5

10,0

0,05

0,05 лот и депонированы в Национальной коллекции микроорганизмов при Венгерском государственном институте эдравоохранения под номером 00287 и/или 00288 и/или

00289, Для увеличения выхода мяса жвачных животных предпочтительно применять в качестве биологически активного ингредиента культуры микроорганизмов, поддерживающие соотношение уксусной и пропионовой кислот в области (2,0 — 3,5);1, например 2:1. Для молочной продукции оптимальное соотношение уксусной и пропионо. ой кислот составляет примерно 3,0:1, для периода стельности 4,0:1, в то время как при выращивании телок (2,0 — 3,0):1.

Пример 1.

A. Селекция таммов микроорганизмов, выделенных из рубца животных, аскармливаемых сеном. .Овец в течени . месяца кормят сеном, затем через оперативно введенную в рубец закрывающуюся фистулу отбирают пробу.

Пробу непосоедственно после взятия отбора селекционируют на специальной питательной среде.

Для получения питательной среды используют 7,5 мл солевого раствора 1, содержащего:

Дикалийгидрофосфат, м 0,6

Дистиллированная вода, мл До 100

7,5 мл солевого раствора II, содержащего:

Хлорид натрия, r 1,2 ульфат аммония, r 1,2

Дигидрофоiфат калия, r 0,6

Хлорид кальция, r 0,12

Гептагидрат сульфата магния, r 0,25

Дистиллированная вода, мл До 100 а также

0,017;-ный раствор резазурина,мл

Агар (бакто), г

Жидкость рубца, мл

Глюкоза, r

Целлюбиоза, r

Моногидрат гидрохлорида цистеина, г 0,05

8 -ный раствор карбоната натрия,мл 5,0

Дистиллированная вода, мл До 100

Обозначение питательной среды RGCA.

Отобранная из рубца проба фильтруется через рыхлый марлевый фильтр, фильтрат затем хранится при -20 в атмосфере CCb.

PH питательной среды устанавливают

6,8, затем среду стерилизуют. Стерилизацию осуществляют в атмосфере С02.

Предварительно среду разбавляют стерильной смесью следующего состава:

0,05

0,3

15,0

15,0

0,05

10,0

Солевой раствор I, мл

Солевой раствор 11, мл

Моногидрат гидрохлорида цистеина, г

SКарбонат натрия,,г

0,1;ь-ный раствор резазурина, мл 0,1

Дистиллированная вода,мл До 100

Обозначение смеси НВ, 10 Культуры инкубируют в течение 120 ч в анаэробных условиях при 35 С, Затем отдельными колониями засевают содержащую сенной экстракт питательную среду следующего состава, Д:

15 Солевой раствор 1

Солевой раствор II

0,1;/,-ный раствор резазурина 0,1

Триптон! 42 1,5

20 Дрожжевой экстракт 0,5

Рубцовая жидкость 10,0

Карбонат натрия 0,4

Моногидрат гидрохлорида цистеина

25 Сенной экстракт

Обозначение RGCF.

Для приготовления сенного экстракта разрезанные на мелкие кусочки части растений суспендируют в воде, кипятят и затем

30 отфильтровывают. Остаток на фильтре перед стерилизацией добавляют к питательной среде. рН питательной среды устанавливают

6,5 с помощью соляной кислоты, затем сре35 ду стерилизуют, Стерилизованные в пробирках питательные среды объемом 5 мл засевают суспензией клеток, полученной иэ изолированных колоний, выросших на твер40 дой питательной среде RGCA. Культуры инкубируют в. течение 5 дней при 35 С при аназробных условиях. Рост контролируют микроскопированием, затем культуру селекционируют на питательной среде RGCA

45 указанного состава. Однако в среду не добавляют глюкозу, целлюбиозу,. используют вместо этого 2 бакто-целлюлозы.

Культуры инку1ирук.г при 35 С в течение.120 ч, затем отдельные колонии, развив50 шиеся на способных усваивать целлюлозу клетках, изолируют путем центрифугирования в атмосфере СО2.

Б. Генетическая маркировка полученных бактерий.

55 Генетическую маркировку осуществляют с помощью Escherlchia coil Плаэмида р.1011.

Плаэмидную ДНК изолируют и растворяют в смеси следующего состава, ммоль:

Хлорид кальция 75

1625317

Хлорид магния 5

Трис-гидрохлоридный буфер, рН 7,5 10

*(Грис) — (о кси метил)-(ами но метан) — гидрохлорид.

Полученные в разделе А клетки суспендируют в смеси следующего состава, ммоль;

Хлорид кальция 75

Хлорид магния 5

Трис-гидрохлоридный буфер, рН 7,5 10

Моногидрат гидрохлорида цистеина 1

Тиосульфат натрия 1

В суспензии содержится 5Х 10 клеток на миллилитр. Суспензию клеток разбавляют в соотношении 1:1 (0,1 мкг/мкл) смесью, содержащей р.1011 плазмидную ДНК, затем инкубируют при 4 С в течение 60 мин.

Далее инкубацию продолжают 2 мин при

41ОС, после чего культуру наносят на плотную питательную среду, содержащую в качестве источника углерода целлюлозу, с добавлением перед стерилизацией 500 мкг/мл канамицина В. Культуры инкубируют 120 ч при 35 С и при анаэробных условиях, затем колонии,- способные расти в присутствии 500 мкг/мл канамицина В, исследуют.

Плазмида р1011 несет гены, определяющие резистентность к канамицину и хлорамфениколу и ori-участок, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках

Е.coli. Так как плазмида ДНК способна реплицироваться только в Е,coli тона, она теряется после того, как попадает в другие бактерии, однако полностью или частично встраивается в хромосомы, т,е. происходит генетическая рекомбинация. Встроенный в хромосом ген проявляется в благоприятном случае и обеспечивает устойчивость к канамицину и хлорамфениколу.

Таким образом получают реэистентные к канамицину В колонии, частота трансформации которых составляет 3 Х10

Некоторые резистентные колонии изолируют и определяют чувствительность к антибиотикам исходных штаммов и резистентных по отношению к канамицину Б (Km ) штаммов. Получены следующие реR зультаты:

Микроорганизмы Минимальная подавляющая рост. концентрация канамицина В, мкг/мл

Содержимое рубца 31

Исходные штаммы 4,0-7,5.

Генетически мар65

20 кированные KmR штаммы: Hh — ОУОК1-1,8 500

27 250

91 500

5 123 1000

142 500

Штамм Hh-ОУОК1-1-123/К наносят на содержащую целлюлозу питательную среду

R GCA с добавлением 1000, 5000 и 10000

10 мкг/мл канамицина В. Культуры инкубируют 168 ч при 35 С в анээробных условиях, затем изолируют выросшие в присутствии

10000 мкг/MR антибиотика штаммы. Таким образом селекционированный штамм, обоз15 наченный как Hh-GYOK-1-123 Sz, синтезируют пропионовую кислоту. Бактерия является грамположительной и имеет палочковидную форму. Глюкоза и крахмал сбраживаются этой бактерией в пропионо20 вую и уксусную кислоты, причем образуется также немного масляной кислоты и углекислоты. На комплексных питательных средах появляются молодые микроорганизмы клеток палочковидной формы, которые позднее

25 превращаются в полиморфные формы различной величины и содержания, не имеющие ресничек и часто расширяющиеся на вершине, становятся шире. Организм также хорошо растет в анаэробных и полуанаэроб30 ных условиях, он факультативно анаэробный. Поэтому штамм, обозначенный как

Hh-6УОК1-1-123 Sz (как и. происходящий от него штамм Hh-GYOK 1-48а) относят к роду Pro pionibacterium. Штамм

35 Propionibacterium sp. (Hh-GYOK-1-123 Sz) депонирован в Национальной коллекции микроорганизмов при Венгерском государственном институте здравоохранения под номером 00287.

40 В, Внесение генетически маркированных микроорганизмов в рубец.

Штаммом Propionibacterium sp.

HNCMB ¹ 00287 засевают стерильную питательную среду RGCFa следующего соста45 ва, мл:

Гидрофосфат калия 0,3;4 45

Сульфат аммония

Хлорид натрия

Моногидрат сульфата

50 магния 4.5

Дигидрат хлорида кальция

Дигидрофосфат калия

Бакто-целлюлоза

Агар (бакто)

55 Дрожжевой экстракт

Моногидрат гидрохлорида цистеина 20

Тиосульфат натрия 20 . Карбонат натрия

Рубцовая жидкость

1625317

Разведение культуры осуществляют при анаэробных условиях в колбах объемом

500 мл, содержащих 150 мл питательной среды. Спустя 48 ч контролируют рост, затем культуру примешивают в корм овец, 5 получающих сено. Перед кормлением и в последующие дни через введенную путем операции в рубец фистулу отбирают пробы бъемом 50 — 200 мл.

Пробы после соответствующего разбав- 10 ления НВ-расгвором наносят на RGCA-пи- ° тательные среды, не содержащие канамицина и других анти зиотиков. l ;óëüòóры инкубируют 72 ч при 35 С в анаэробных условиях, затем определяют число развив- 15 шихся колоний бактерий. Животному вводят орально 340 мп культуры, содержащей

4,7 X 10 бактерии на миллилитр. Результаб ты представлены в табл, 1.

Из данных табл. 1 следует, что введен- 20 ный микроорганизм длительное время существует в рубце и размножается, Животному также вводят орально 140 мл культуры Propionibacterlum sp., содержащей 2 X 10 клеток на миллилитр. Результа- 25 ты представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, что введенные микроорганизм имеется в значительном количестве в рубце, а также размножается. 30

Пример 2.

А. Селекция штаммов микроорганизмов, выделенных из рубца животных, вскармливаемых зерновыми продуктами.

Культуру получают аналогично и, А при- 35 мера 1 с тем различием, что исходную пробу отбирают иэ рубца животных, вскармливаемых зерновыми продуктами, Отдельные изоляты высевают на RGCF-среду, содержащую вместо сена измельченное в порошок 40 зерно (2 P). Выросшие в жидкой RGCF-среде культуры наносят на плотную КОСА-сред и из такой питательной среды изоЛируют колонии, развившиеся из клеток, усваивающих зернов ле продукты, 45

Б, Генетическая маркировка бактерий, разрушающих крахмал, Осуществляют аналогично и. Б примера 1, Реэистентность по отношению к кана- 50 мицину В некоторых трансформированных и Кп штаммов следующая:

Микроорганизм Минимальная подавляющая рост концентрация 55 канамицина В, мкг/мл

Содержимое желудка 31

Исходные ш гаммы 1,8

Генетически маркированные К -штаммы;

Hh — GYOK1 — 2 — 4 250

14 АЬ 250

37 250

81 125

Селекционированный штамм, обозначенный как Hh-ОУОК1-2-14АЬ, неподвижный, грамотрицательный, не вырабатывает пигментов.

Хорошо растет в анаэробных условиях при 37 С. В большом количестве появляются сферические клетки и располагаются одна рядом с другой. Их средняя величина составляет 0,3 — 0,4 мкм, Сбраживает углероды до кислоты и углекислого газа. На комплексных питательных средах образует сероводород, не разжижает желатину, гемолиза не вызывает, Поэтому штамм, обозначенный как Hh-GYOK1-2-14АЬ, относят к роду Veil onella.

Штамм Veilonelta sp, (Hh-GY ОК1-214АЬ) депонирован под номером 00288 в

Национальной коллекции микроорганизмов при Венгерском государственном институте здравоохранения.

В. Внесение генетически маркированных микроорганизмов в рубец, Определяют аналогично пункту В примера 1 с тем различием, что используют штамм ЧеИопеИа sp. (Hh-6УОК1-2-14АЬ) и засевают стерильную RGCFa-среду, содержащую вместо бактоцеллюлозы 1,87ь растворимого крахмала. Затем культуру примешивают в корм животных, получающих зерно. Перед введением и затем ежедневно через фистулу отбирают пробу.

Животному вводят орально 310 мл культуры, содержащей в целом 7,1Х 10 бактерий.

Число содержащихся в пробах К клеток

R указано в табл, 3, Иэ табл, 3 видно, что введенный микроорганизм длительное время остается живым и размножается.

Пример 3, А, Селекция штаммов микроорганизмов, выделенных i.з рубца животных, вскармливаемых мелассой.

Культуру получают аналоги:.но пункту А примера 1 с тем различием, что исходную пробу отбирают из рубца животных, которы.-, кормят мелассой. Отдельные иэоляты высевают на R GCF-среду, содержащую вместо дрожжевого экстракта глюкозу, Развившиеся в жидкой питательной среде культуры наносят íà R GCA-среду. На такие же питательные среды высевают колонии, которые развились из клеток способных усваивать мелассу.

1625317

Таким образом получают происходящие из рубца микроорганизмы, которые могут метаболизировать мелассу.

Б. Генетическая маркировка использующих мелассу бактерий.

Осуществляют аналогично пункту Б примера 1.

Резистентность некоторых Km -клеток

R по отношению к канамицину В следующая:

Микроорганизм Минимальная подавляющая рост концентрации канамицина В, мкг/Mll

Содержимое рубца 31

Исходные штаммы 7,5

Генетически маркированные Km -штаммы:

Hh — 6УОК1 — 3 — 2 250

14 500

34 250

81 Ме 500

132 500

Селекционированный штамм, обозначенный как Hh-6УОК1-3-81 Ме, факультативно анаэробный, грамположительный.

Клетки имеют палочковидную форму, неподвижны. Концы палочек сдавлены, Образует уксусную кислоту, ферментирует глюкозу до молочной кислоты. Палочки растут на различных питательных средах, редко по отдельности, в большинстве случаев в форме цепочек. Не образует пигмента, Поэтому штамм относят к роду Bifidobacterium.

Штамм Bifidobacterium sp, (Hh-6УОК13-81Ме) депонирован под номером 00289 в

Национальном собрании микроорганизмов при Венгерском государственном институте здравоохранения.

В. Внесение генетически маркированных клеток в рубец.

Поступают согласно и. В примера 1 с тем же различием, что штаммом

BifIdobacterium sp, HNCMB М 00289 (HhOYOK-3-81 Me) засевают R GCF-а-среду, содержащую вместо целлюлозы 1,87, глюкозы. Культуру примешивают в корм животных, получающих мелассу. Перед кормлением и затем ежедневно через введенную в рубец фистулу отбирают пробы, Животному вводят орально 380 мл культуры, которая содержит 1,6 Х 10" клеток на миллилитр.

Число содержащихся в пробах Кп -клеR ток указано в табл. 4.

Из данных табл. 4 видно, что введенный микроорганизм длительное время находится в рубце животного.

Пример 4. Изменение соотношения продуцируемых в рубце летучих жирных кислот при использовании полученных бактерий.

0,08

0,3

0,5

0.05

0,008

0,3

2,0Две овцы получают комплексный корм (смесь иэ сена и овечьего корма). затем спустя 14 дней через фистулу отбирают иэ рубца пробу, 2 л рубцового сока фильтруют

5 через многослойную марлю, фильтрат отделяют. Остающиеся на марле кусочки суспендируют в 1 л физиологического буфера, затем после перемешивания также фильтруют. Оба фильтрата обьедйняют, оставляют

10 стоять, спустя 1 ч удаляют абсорбирующиеся на поверхности твердые вещества, дл исследования используют только жидкость

Состав физиологического буфера следу ющий, г/л:

15 Динатрийгидрофосфат (гидрофосфат натрия 0,316

Дигидрофосфат калия 0,152

Гидрокарбонат натрия 2,260

Хлорид калия 0,375

20 Сульфат магния 0,112

Дигидрат хлорида кальция 0,050

Гептагидрат сульфата железа (11)

Моногидрат сульфата

25 магния О;004

Гептагидрат сульфата цинка 0,004

Пентагидрат сульфата меди 0,002

Гексагидрат хлорид кобальта (11) 0,001

30 рН смеси контролируют, в случае необходимости устанавливают равным 7,2 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты или раствора гидроксида натрия.

35 Полученную смесь в соотношении 1:1 разбавляют указанным выше физиологическим буфером; и в 1 л раствора добавляют

4 r кормовой смеси. По 30 мл полученной суспензии заполняют в колбы Эрленмейера

40 обьемом 100 мл, затем 200 порций предварительно подготовленной питательной среды стерилиэуют, 200 следующих порций не стерилиэуют и засевают полученными по примерам 1-3 бактериями, .

45 Исследуемые бактерии инкубируют при

37 С в анаэробных условиях. в течение 48 ч на R GCA + CG-питательных средах следующего состава, :

Солевой раствор i

50 Солевой раствор П

Раствор микроэлементов . Дрожжевой экстракт

Отфильтрованная жидкость рубца 10,0

55 Карбонат натрия 0,4

Моногидрат гидрохлорида цистеина

Тиосульфат натрия

Целлюлоза (бакто)

Глюкоза

1625317

Состав раствора микроэлементов следующий, мг:

Хлорид цинка 40

Дигидрат хлорида меди (И) 10

Декагидрат тетрабората натрия 10

Тетрагидрат малибдата аммония 10

Гексагидрат трихлорида железа 200

Тетрагидрат хлорида мар р ганца (!!) 10

Свободная от ионов в да, мл До 1000

Культурами засевают предварительно приготовленные, как указано выше, питательные среды в колбах Эрленмейера, Посев осуществляется в соотношении 2 мл культуры на 50 м питательной среды. Так же высевают нестирильную культуру.

Посев инкубируют в течение 40 ч при анаэробйых условиях, затем размножение прекращают с помощью 10 ф, концентрированной муравьиной кислоты и исследуют содержание летучих жирных кислот. Для этого культуры фильтруют через марлю и затем в течение 15 мин центрифугируют в роторе с числом оборотов 4000. Смесь еще раз фильтруют и затем для определения жирных кислот с 2 — 5 С-атомами вносят в разделительную колонку газового хрома1ографа, снабженного плазменно-иониэационным детектором, Температура колонки 150 С.

Разделительная колонка длиной 2 м, стеклянная трубка с внутренним диаметром 4 мм; заполнение. 1С% зтиленгликольадипинат+ 2;(, ортофосфорной кислоты на силанизированном силикагелевом носителе (0,2 — 0,3 мм). Температура инжектора 190 С.

Скорость потока Nz 50 мл/мин. Скорость потока Hz 50 мл/мин, Скорость потока воздуха 200 мл/мин. Скорость бумаги 160 см/ч.

Время хроматографирования 20 мин. Количе=тво пробы 1 м;;л.

Для каждой пробы осуществляют 4 параллельных измерения.

Стандартный раствор содержит уксусную, пропионовую, иэомасляную, масляную, изовалериановуо и валериановую кислоты, Полученные результаты представлены в табл. 5, В табл. 5 использованы следующие обозначения;

+S — высевается после стерилизации;

NS — высевается из пробирки, содержащей живую флору рубца; а — незначительное количество;

Ь вЂ” отрицательный контроль: содержание в питагельной среде (жидкость рубца, 10

30 физиологический буфер и корм) летучих жирных кислот (среднее из 12 измерений); с — положительный контроль; содержание в содержащей первоначальные бактерии рубца и инкубированной культуре (питательная среда из жидкости рубца, фиэ;".ологического буфера и корма) летучих жирных кислот (среднее из 12 измерений);

d — аналогично с, но в питательной среде с добавлением 5 ppm моненцина (натриевая соль), среднее из 6 измерений; е — как и с, но в питательной среде с добавлением 100 ppm моненцина (натриевая соль), среднее из 6 измерений.

Иэ данных табл, 5 видно, что при введении предлагаемых культур микроорганизмов соотношение образующихся в рубце летучих жирных кислот может изменяться в широких пределах. С помощью полученной из штамма Hh — GYOK — 48а культуры можно, например, повысить количество образующейся пропионовой кислоты, одновременно благодаря культуре микроорганизма

Hh — 6УОК1 — 109в повышается количество образующейся уксусной кислоты. Увеличение количества образующихся отдельных жирных кислот можно наблюдать также на питательных средах, которые не содержат никаких других микроорганизмов (S) или в присутствии обычных бактерий рубца (NS).

В используемой опытной системе с натриевой солью моненцина соотношение уксусная кислота/пропионовая кислота (d, е) уменьшается на "-2 десятых.

Пример 5. Получение бактериального препарата для кормления животных.

Вводимую бактерию выращивают íà R

GCA+ CG-питательных средах указанного в примере 4 состава в анаэробных условиях, После выращивания клетки известным образом отделяют, например, путем фильтрации или центрифугирования. Отделенные кле гки суспендируют в физиологическом буфере (см. пример 4) и подвергают сушке

55 вымораживанием, Лиофилизированный бактериальный препарат собирают. и при известных условиях в виде соответствующего препарата ввод..т (задают ) животным.

Разведение культуры микроорганизмов можно осуществлять также на других известных питательных средах, например на питательных peðàõ, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, крахмал и т.д., в качестве источника азота — неорганические сали, Препарат можно вводит. в смеси с кормом, питьевой водой, самостоятельно или вместе с другими биологическими активными веществами, например с антибиотиками, витаминами. i 4

13

1625317

Кроме лиофилизированного препарата можно приготовлять также другие продукты. Микроорганизм можно вводить также после смещения отделенной путем центрифугирования или фильтрации массы бакте- 5 рий с соответствующими носителями или разбавителями, например с карбонатом кальция, зерновыми культурами, премиксом или другими кормовыми средствами.

В зависимости от применяемого корма 10 и от направления выработки устанавливают, какой из приготовленных с помощью предлагаемого сп соба и благоприятно влияющих на флору рубца микроорганизмов воспринимается и в каком количестве. Если 15 нужно снизить частное уксусная кислота— пропионовая кислота, то вводят, например, культуру штамма Propionibacterium sp.

HNCMB N 00287, если нужно увеличить это частное, то дают, например, культуру микро- 20 организма Bifidobacterium sp. HNCMB

N 00289 (Hh — ОУОК1 — 3 — 81Ме). Если вводят связывающие азот бактерии, то количество вводимого жвачным животным органического источника азота может уменьшаться. 25

Культуру вводят в таком количестве, чтобы в

1 мл содержимого рубца функционировало около 5 X 10 и 5 X 10 клеток.

Пример 6.

А, Получение сухого замороженного 30 препарата.

Полученная в соответствии с примером

5 путем центрифугирования влажная бактериальная паста ОŠ— 950 весом 100 г лиофилизируется в установке для сушки 35 сублимацией. Затем полученные 54 г продукта тщательно смешивают с 486 r пшеничных отрубей и помещают в обеспечивающий защиту бактерий мешок (непроницаемый для бактерий). Получают 40 препарат, содержащий 10% биологически активного вещества.

Б. Получение препарата, содержащего в качестве носителя пшеничные отруби. i00 г полученной в соответствии с при- 45 мером 5 путем центрифугирования влажной пасты микроорганизма равномерно перемешивают со 100 r или 900 г пшеничных отрубей, затем помещают в обеспечивающий защиту бактерий мешок или контейнер. 50

Таким образом получают содержащий 5 или

10% биологически активного вещества препарат.

В, Получение препарата, содержащего в качестве носителя бантонит. 55 i00 кг бентонитного порошка стерилизуют при 160 С в течение 2 ч, затем после охлаждения до комнатной температуры помещают в смеситель. Смеситель приводят в действие, с помощью дозатора жидкостей. распыляют 10 кг полученной в соответствии с примером 5 суспенэии.микроорганизмов.

Полученную суспензию высушивают при

30 C до достижения влажности 6 — 8% и помещают в обеспечивающие защиту бактерий мешки (емкости).

5 г продукта хранят при 4 С, при комнатной температуре или при 37 С, на нулевой, 20-й, 51-й и 72-й день берут пробы, затем препарат суспендируют в стерильный

HB-смеси и после соответствующего разбавления засевают на агар ЙОСА. Выращивание осуществляют 48 ч в анаэробчых условиях, затем определяют количество выращенных колоний.

Результаты приведены в табл. 6, Из данных табл. 6 видно, что количество бактерий в продукте, содержащем бентонит, практически не изменяется.

Г, Получение препарата, содержащего в качестве носителя аттапульгит.

100 кг коллоидного аттапульгита стерилизуют 2 ч при 160 С, затем после охлаждения до комнатной температуры помещают в смеситель.

Смеситель приводят в действие, и через насадку дозатора жидкостей полученная в соответствии с примером 5 распыляемая суспензия микроорганизмов в количестве

10 кг распрыскивается на аттапульгит.

Полученную дисперсию высушивают при 30 С до достижения влажности b u помещают в обеспечивающие защиту бактерий мешки (емкости).

По 5 r продукта хранят при 4 С, при комнатной температуре или при 37 С, затем на нулевой, 20-й, 51-й и на 72-й день берут пробы. Препарат суспендируют в стерильной НВ-смеси и после соответствующего разбавления засевают на агар RGCA. Выращивание осуществляют 46 ч в анаэробных условиях, затем определяют количество выращенных колоний, Результаты приведены в табл. 7. Из данных табл, 7 видно, что количество бактерий в продукте, содержащем аттапульгит, не изменяется.

Пример 7. Питательную среду RGCA

+ CQ указанного в примере 4 состава засевают культурой штамма Propionibacterium

sp. HNCMB М 00287 (Hh — GY0K1 — 1 — 123Sz).

Выращивание осуществляют в двух ферментерах с полезным объемом 5 л при 37 DÑ в анаэробных условиях. Ферментацию начинают с посева 10 мл приготовленного на питательной среде такого же состава инокулята и продолжают в течение 48 ч. Затем клетки отделяют центрифугированием в роторе с числом оборотов 5000/мин и получен15

1625317

Таблица 1

Таблица 2 ный отцентрифугированный влажный осадок в количестве 53 г тщательно смешивают с 4 кг кукурузного шрота, Смесь разделяют на 8 частей и вводят 8-ми овцам. Животных предварительно заставляют голодать один день.

Животные получают препарат в возрасте 3 мес. В качестве контроля служат 8 животных, После дачи препарата продолжают кормление сеном, еженедельно определяют вес животных. Корм: луговое сено ad

libitum (600 — 900 г/день) и 100 г/день добавки минеральной соли и витамина в носитель из кукурузного шрота.

Результаты указаны в табл. 8.

Из приведенных данных рассчитывают средний ежедневный прирост веса одного животного. Результаты приведены в табл. 9.

У животных контрольной группы при скудном корме в течение 35 дней отмечается прирост веса 360 r; у обработанных штаммом Propionibacterlum sp. НЙСМВ М 00287

{Hh ОУОК1 — 1 — 123Sz) животных увеличение веса 2620 г; у обработанных штаммом Hh5. 6УОК1-48а животных прирост веса 3875 г.

Из приведенных данных видно, что полученные с помощью предлагаемого способа препараты значительно повышают прирост веса овец.

Формула изобретения

Способ получения препарата для кормления жвачных животных, включающий смешивание культуры микроорганизмов с

15 целевыми добавками, отличающийся тем, что, с целью повышения продуктивности, в качестве культур микроорганизмов используют штамм Propionibacterlum sp.

HNCMB М 00287, или штамм Vellonelta

20 sp. HNCMB М 00288, или штамм

Blfidobacterium sp, HNCMB М 00289.

1625317

Таблица 3

Т аблица 4 еправильный отбор пробы, Таблица 5

Пропионовая кислота, мкг/мл

Бактериаль- Применый штамм чание

Изовэлериа.новаяя кислота, мкг/мл

Уксусная кислота, мкг/мл

Изомас- Масляляная ная кискислота, лота, . мкг/мл мкг/мл

Валериановая кислота, мкг/мл

Уксусная (пропионовая кислота а

0,09 а а контроль

НЬ-6УОК1 — 1 — 123SZ

НЬ-6УОК1

- -14Ab

НЬ.ОУОИ

-3-81Ме Ь с

О е

HtrGYOQ

NS

NS

NS

1,71

2,00

0,38

1,95

2,21

2,81

1,51

1,68

1,69

1,61

1,87

2,60

0,58

1,36

0,67

0,81

0,74

0,91

1,08

0,91 а а а а а а а а а

0,35.

0,50

0,35

0,52 а а

0,39

0,51

0,41

0,37 а а

0,12 а а

0,11 а а

0,91

0,77

0,65

1,43

3,29

3,47

2,04

1,84

1,67

1,77

1625317

Продолжение табл. 5 а

0,48 а

0,15 а

0,15 а

0,14 а

0,11 а

0,70

Таблица 6

Т а б л и ц а 7.

Та блица 8

Не ели

Исходный вес

Конт оль

29,5

28,0

26,5

29,0

30,0

27,5

28,0

29,5

26,5

26,5

30,0

29.5

26,0

28,0

29,5

27,0

27,5

30,5

30,5

26,0

28,0

30,0

28,5

27,0

30,0

29,0

26,5

27,5

29,5

27,5

27,0

30,5

30,0

25.5

27,0

29,0

27,0

28,5

30,0

29,5

25,0

27,0

Обработано штаммом Propion)bacterium зр. HNCMB N. 00287 (Нп-GYOKI

N. 1-123Sz

34,0

29,0

28,5

28,0

30,0

30,5

33,5

29,5

29,0

27,0

29,0

29,5

33,0

28,5

28,0

27,5

28,5

29,5

32,5

27,0

25,0

25,5

29,0

30,0

32,0

26,5

25,5

24,5

28,0

30,0

29,5

25,5

25,0

25,5

29,0

29,5

Hh — GYOKI48a

Hh — GYOKI — 50а

Hh GYOKI — 51а

Hh-GYOKI-55a

Hh — GY0Kt-113

Hh — G YOKI-122

Hh — GYOKI — 1096

Hh — GYOKI — 126

NS

NS

NS

NS

NS

NS

NS

NS

1,26

1,21

1,44

1,73

2,37

2,02

2,10

2,18

1,39

1,77

1,31

2,02

2,49

2,92

0,56

0,83

1,60

2,38

1,56

2,01

0,47

0,70

0,51

0,78

0,67

0,60

0,87

0,91

0,45

0,36

0,60

1,14 а а а а а а а а а а а а а а а

0,32

0,34

0,34

0,35

0,36

0,35

0,34

0,37

0,34

0,27

0,31

0,31

0,29

0,30

0,52

1,55

0,79

0,51

0,92

0,86

5,04

2,89

4,12

2,79

2,07

2,95

1,50

2,22

5,53

8,11

0,93

0,73

1625317

21

22

Продолжение табл. 8

Таблица 9

Составитель В, Романова

Редактор M. Циткина Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Л, Патай

Заказ 204 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101