Способ обработки электрофореграмм

Способ обработки электрофореграмм

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии и химии, может использоваться в биохимических , клинико-биохимических и химических исследованиях, когда необходимо применение методов разделения посредтвом электрофореза в гелях. Цель изобретения заключается в повышении точности определения электрофоретических разделяемых компонентов Цель достигается благодаря точности предварительного определения минимально необходимого времени прокрашивания гелевых электрофореграмм, обеспрчивающего обязательное полное окрашивание этих электрофореграмм путем прокрашивания одинаковых гелевых электрофореграмм в одинаковых условиях при разных выдержках (ti и 12) фотографирование гелевых электрофореграмм измерение на полученных фотопроекциях площадей($1 и 82) зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, и определение минимально необходимого времени прокрашивания по формуле 1Мин (Sit2 -S2n)/(Si - 82) Способ позволяет точно определить количество и соотношение разделенных электрофорезом фракций, минимально необходимое время полного прокрашивания электрофореграмм , предотвращает излишние расходы реактивов и рабочего времени, позволяет варьировать условия окрашивания электрофореграмм 2 ил Р и L

СОЮЗ СОНЕТСКИК

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4490973/25 (22) 27,06.88 (46) 15.02.91, Бюл. М 6 (71) Ленинградский медицинский институт им. акад. И.П. Павлова и Витебский медицинский институт (т2) Н,Н. Никандров, В.П, Фаенкова и И.Г. Щербак 53) 543.257 (088.8) (56) Маурер Г. Дискэлектрофореэ. M.: Мир, 1971, с. 247.

Barret I.0. John Е.V,J. Chromatgor, 1973, 75, р. 161, (54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЭЛЕКТРОФОРЕ г РАММ (57) Иэобрете;-ие относится к биохимии и химии, может использоваться в биохимических, клинико — биохимических и хи ических исследованиях, когда необходимо применение методов разделения посредтвом электрофореза в гелях. Цель изобретения заключается в повышении точности определения электрофоретических разделяемых

Изобретение относится v биохимии и химии и может использоваться в биохимических, клинико-биохимических, химических исследованиях. в химической, пищевой, парфюмерной, химико- фармацевтической отраслях промышленности, при биогехнологических производствах, во всех случаях. где необходимо применение методов разделения посредгтвом электрофореэа в гелях.

Целью является повышение точности определения при сд| овременной экономи 1 реактивов.

„., 5U„„1627965 Al компонентов. Цель достигается благодаря точности предварительного определения минимально необходимого времени прокрашивания гелевых электрофореграмм, обеспечивающего обязательное полное окрашивание этик электрофореграмм путем прокрашивания одинаковых гелевых электрофореграмм в одинаковых условиях при разных выдержках (ti и tz), фотографирование гелевь х электрофореграм, измерение на полученных фотоп роекциях площадей (5 | и Sz) зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, и определение минимально необходимого времени прокрашивания по формуле t<» =(Sitz -Szti)/(Si — Sz).

Способ позволяет точно определить количество и соотношение разделенных электрофорезом фракций, минимально необходимое время полного прокрашивания электрофореграмм, предотвращает излишние расходы реактивов и рабочего времени, позволяет варьировать условия окрашивания электрофореграмм. 2 ил.

На фиг. 1 и 2 ||редставлены фотопроекции окрашенных гелевых электрофореграмм.

Время выдержки фиг. 1 — 16 (A), 20 (Б) и

34,3 или 35 (В) ч, фиг. 2 — 16 (А), 12 (Б) и 26,8 (В| ч.

Способ может быть осуществлен следующим образом.

Для каждой системы с ее особенностями (свойства и размеры геля. особенности и количество фракционируемого Ma1ериала, характер и концентрация красителя и т n,) предварительно определяют минимально

1627965

10

5

10 необходимое время инкубации (прокрашиеания) разогнанных электрофореграмм в данном растворе красителя, Для этого две электрофореграммы с расфракционированным материалом, представляющие собой гелевые столбики (ГЭ1 и ГЭ2), выдерживают в растворе красителя в течение времени, соответственно ti u tz (причем ti Х(2, например tz = 1,2 - 1,25ti, и наоборот). Затем

ГЭ1 и ГЭ2 отмывают обычным способом от излишков красителя (е местах, свободных от фракционируемого материала) и фотографируют. На полученных фотопроекциях (фиг. 1 и 2 А и Б) с помощью палегки со стороной квадрата в 1 мм, определяют площади неокрашенных зон по внешней границе замкнутой кольцевой (оеальной или грушеобразной) зоны 1, ограниченной усиленно "окрашенным" контуром (соответственно Si и Sz). По площади указанных зон и соответствующему им времени выдержки ГЭ в растворе красителя (соответственно ti и12) рассчитывают минимально необходимое время (тмин„) для полного прокрашивания ГЭ в конкретных условиях по формуле

Sitz — Szti мин =

Пример. Все использованные в эксперименте гелевые электрофореграммы (ГЭ) представляли собой столбики 15)(,-ного полиакриламидного геля (содержащего 2,5 М мочееины) высотой 100 мм и диаметром 6 мм. В каждом столбике предварительно было осуществлено с помощью электрофореза (в идентичных условиях) фракционирование 40 мкг тотальногп препарата гистонов тимуса теленка. Фракционирование осуществляли е течение 2,5 ч при силе тока 1,8-2 MA с использованием модели прибора 73 для электрофореза фирмы

"Реанал" (Венгрия), а в качестве электродного буфера — 0,9 М раствора уксусной кислоты (рН 3,2), Каждую из полученных описанным способом ГЭ помещали для окрашивания в

10 мл 0,05 — ного раствора Кумасси бриллиантового синего, растворенного в смеси изопропанола и 0,9 М уксусной кислоты (в обьемном соотношении 1:3).

Две идентичные гелевые электрофореграммы — ГЭ1 и ГЭ2 — выдерживали в растворе красителя соответственно 16 и 20 ч, где

16 ч — время ti, а 20 ч — время tz, Таким образом, ti = 16 ч — это время. рекомендованное литературой. а tz сотавляет 1,25 1.

Затем ГЭ1 и ГЭ2 отмывали обычным путем от излишков красителя (в 0.9 М уксусной кислоты). Полученные ГЭ1 и ГЭ2 имели вид, представленный соответственно на фиг. 1А и 1Б. ГЭ1 и ГЭ2 фотографировали и на их фотопроекциях определяли соответственно

Si u Sz — площади тех зон расфракционированного гистоноеого материала, которые ограничены контуром наиболее интенсивной окраски. включая площади полосок собственно контура, обозначенных стрелками на фиг. 1А и 1Б, При измерении площадей (Si и

Sz) пользовались палеткой со сто >оной квадрата 1 мм. Минимально необходимое время прокрашиеания ГЭ-м рассчитывали по формуле:

S1t2 3211

1мин

51 S2

64,0мм х 20ч — 50,0мм х 16ч 34 3 — 34.3ч

64,0мм — 50,0мм

После этого осуществляли прокрашивание ГЭ в избранных условиях с учетом того, что, минимально необходимое время прокрашивания составляло 34,3 ч, Полученные таким образом ГЭ имели вид, представленный на фиг. 1В (т. е. были полностью прокрашены), На таких электрофореграммах разделение компонентов гистонового материала было четко видно и было представлено четырьмя основными фракциями, отсутствовала неравномерность окрашивания, в том числе и за счет исчезновения "контурных" границ.

Способ позволяет варьировать условия окрашивания электрофореграмм в зависимости от особенностей эксперимента (характер геля, фракционируемого материала, красителя, и т. д.) и позволяет сделать выбор между экономией красителя за счет увеличения длительности прокрашивания или экономией времени за счет повышения концентрации красителя в окрашивающем растворе. Таким образом, предлагаемый способ гарантирует правильность выявления фракций злектрофоретически разделяемого материала за счет обеспечения полноты их окрашивания.

Формула изобретения

Способ обработки электрофореграмм путем их окрашивания, о т R и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности определения при одновременной экономии реактивов, окрашивают две одинаковые гелевые электрофореграммы в одинаковых условиях при разной выдержке в растворе красителя, фотографируют отмытые гелевые электрофореграммы, на полученных фотопроекциях измеряют площади зон. ограниченные контуром наиболее

5 1627965

Г

А Б 3

Фиг. I

А Б Б

Фиг. 2

Составитель И. Рогаль

Техред М.Моргентал Корректор Н. Ревская

Редактор Н. Горват

Заказ 337 Тираж 395 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Рэушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 интенсивной окраски, и минимально необходимое время прокрэшивания рассчитывают по формуле

» > — Йи тмин где S> и Sg — площади зон, ограниченных контуром наиболее интенсивной окраски, на фотопроекциях гелевых электрофореграмм при выдержке в красителе соответст5 венно t) и т2.