Способ выделения пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба cerrena махiма murr

Способ выделения пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба cerrena махiма murr

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, котомогут быть использованы для аналитических целей в микробиологической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидазного метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики, Целью изобретения является повышение удельной активности пероксидазы, чистоты препарата и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента . Способ заключается в том, что выделение пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба Cerrena maxima Murr проводят с использованием аффинного сорбента на основе альгинатного волокна, содержащего в своей структуре альбумин, ковалентно связанный глутаровым альдегидом. Обратимое взаимодействие пероксидазы с аффинным лигандом альбумином обеспечивает строгую специфичность по отношению к ферменту, Комплекс альбумин - пероксидаза разрушается в процессе десорбции 0,2 М уксусно-ацетатным буфером рН 4,7, причем пероксидаэа переходит в раствор, а селективный сорбент остается работоспособным для следующего цикла сорбции-десорбции . Применение нового селективного сорбента позволяет получить пероксидазу из культурального фильтрата с высокой удельной активностью

QQQ3 СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51) 5 C 12 N 9/08

\ яп 1 Й

: ° 4 .а

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к вто скомм свидктельствм

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

,21) 4642957/13 (22) 26. 12. 88 (46) 23.02.91. Бюп. У 7 (71) Ленинградский институт текстильной и легкой промппленности им. С.M Êèðîâà и Ботанический институт им. В.Л.Комарова (72) Н.И.Свердлова, В.П. Гаврилова, И,И.Шамолииа, Т. Н. Калинина, Е.Л.Илларионова, E. Н.Алексеева и И.Б.Курочкина (53) 577.15,07 (088.8) (56) Гаврилова В. П., Шамолина И.И., Степанова Л,С. Иммобилизация пероксидаэы из культурального фильтрата базидиального гриба Сеггепа maxima

Murr. - Прикладная биохимическая микробиология, 1981, т. 17, Р 2, с. 261264.

Свердлова Н.И., Данилова Е.Я., Шамолина И.И, Вольф Л.А. Изучение взаимодействия ионообменных полиакрилонитрильных волокон с пероксидазой иэ базидиального гриба Cerrena maxima Ицгг. " Химическая технология, свойства и применение пластмасс: Межвузовский сборник научных трудов.

Л.: ЛТИ им. Ленсовета, 1985, с. 123131. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЦ1ИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ

КУЛЬТУРАЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА CERRENA MAXIMA MURR (57) Изобретение относится к производству ферментных препаратов, котоИзобретение относится к производству ферментных препаратов, которые

2 могут быть использ ованы для ана— литических целей ы микробиологической промышленности, в медицине для осуще ствле ния иммунолеро ксид as но ro метода гистологических исследований, проводимых в целях диагностики, Целью изобретения является повышение удельной активности пероксидазы, чистоты препарата и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента. Способ заключается в том, что выделение пероксидазы из культурального фильтрата базидиального гриба

Ce r rena maxima Mu r r проводят с использованием аффинного сорбента на основе альгинатного волокна, содержащего в своей структуре альбумин, ковалентно связанный глутаровым альдегидом.

Обратимое взаимодействие пероксидазы с аффинным лигандом альбумином обес- (, печивает строгую специфичность по от ношению к ферменту. Комплекс альбумин — пероксидаза разрушается в процессе десорбции 0,2 И уксусно-ацетат- щ» ным буфером рН 4,7, причем перокси- @ даэа переходит в раствор, а селективный сорбент остается работоспособным для следующего цикла сорбции-десорбции. Применение нового селективМного сорбента позволяет получить пе- ©» роксидазу иэ культурального фильтрата с высокой удельной активностью (68,7 ед. /мг белка), чистотой (R =

=0,87) и высокой термостабильностью.

4 табл. . 3 могут быть использованы для аналитических целей особенно в микробиоло1629316 гической промышленности, в медицине для осуществления иммунопероксидазного метода гистологических исследований проводимых в целях диагности9

5 ки е

Целью изобретения является повышение удельной активности, чистоты препарата пероксидазы и его термостабил ьности с сохр анение м суммарной активности фермента.

Способ заключается в том, что в предлагаемом способе выделение пероксидазы из культур ального фильтр ата (КФ) базидиального гриба Cerrena ma"

xi ma Nurr используют волокнистый сорбент из альгинатного волокна с содержанием альдегидных групп глутарового альдегида 0,85-0,90 мас. . и альбу1 1- 1 3 Ml /r HolloKHa, Волокнистыи сорбент с указанным содержанием альдегидных групп глутарового альдегида и альбумина обеспечивает согласно спосо1 бу возможность получения пероксидазы с удельной активностью 68,3 ед/мг 25 белка, чистотой ИХ=09 87, термостабильностью при инкубации в течение 10 мин при 80 С 97Х и при 90 С 78 от исходной активности с сохранением суммарной активности по сравнению с исходной 81,1Х.

Пример ы 1-12, Апьгинатные волокна сформовань1: из 9 -ного водного раствора альгината натрия с рН

6 в осадительную ванну, содержащую 5Х хлористого кальция и 3 ммоль/л соляной кислоты.

Температура приготовления: прядильо ного р аст вор а 60 С, те мне р атур а формования 30 С, температура осадительо ной и пластификационной ванн 20 С.

Скорость формования 2,5 м/мин, величины фильерной и пластификационной вытяжек 140 и 85 соответственно. Ппастификационное вытягивание проводят в среде изопропилового спирта, Апьгинатные волокна имеют абсолютную разрывную нагрузку 14,8 сН, относительное разрывное удлинение 1997%.

Альгинатное волокно массой 10 r9 модифицированное глутановым апьдегидом с содержание.м альдегидных групп

0,80 мас. обрабатывают раствором апьбумина с концентрацией 1 мг/мп при

18+2 С в течение 60 мин. Получают волокно с содержанием 9 мг/г ковалентно присоединенного альбумина. Продукт, промывают дистиллированной водой и обрабатывают 1000 мл КФ базидиально-.

ro гриба Се r rena maxi ma ии г г в течение

20 мин при 18+2 гС. Затем волокно отделяют от жидкой фазы и промывают дистиллированной водой до отсутствия в промывных водах белка. Разрушение комплекса альбумин-пероксидаза осуществляют 500 мл 0,2 М уксусно-ацетатного буфера в течение 10 мин при

18+2 С. Раствор белка в указанном буо фере подвергают диалиэу против воды в течение 24 ч и лиофильной сушке. В полученном препарате определяют пероксидазную активность по скорости расщепления пероксида водорода с применением о-дианизидина как донора водорода9 которую измеряют по изменению скорости развития окраски при

460 нм. Содержание белка определяют по изменению окраски красителя

Coomassi c 81ое. Термостабильность устанавливают путем инкубации испытуемого образца в 0,01 М ацетатном буфере при 80 и 90 С в течение 10 мин.

Активность вьщеленной пероксидазы составляет 63,5 от исходной, удельная активность 50, 7 ед. /мг, чистота фермента К 0,63, термостабильность9 характеризуемая сохранением активнос- . ти препарата фермента, при 80 C cocо тавляет 81Х, при 90 С вЂ” 53 .

Характеристика пероксидазы, вьщеленной из КФ Сеггепа maxima Hurr селективными сорбентами волокнистой структуры, с различным содержанием альдегидных групп и альбумина приведена в табл. 1.

Анализ данных табл. 1 показывает, что уменьшение содержания альдегидных групп (менее 0,80 мас. ) невозможно, так как альгинатное волокно набухает и разрушается в процессе десорбции уксусно-ацетатным буфером, о чем свидетельствует изменение усадки волокна от 2,5 при содержании альдегидных групп 0,77 мас. . (пример 3) до 5,4g при содержании альдегидных групп 0,87 мас.Х и выше (примеры 6-12). Увеличение содержания альбумина в,волокне влечет за собой повышение выхода пероксидазы от

63,5 до 81,1 от начапьного содержания по активности в КФ. Увеличить содержание апьбумина в альгинатном волокне (более 13 мг/г) экспериментально не удалось, Удельная активность также возрас- тает от 50 7 (пример 6) до 68,3 ед,/, /мг (пример 12) при увеличении чис5 16293 тоты препарата, характеризуемой пока зателем R» который возрастает в указанном ряду от .0,63 до 0,87. Термостабильность выделенного препарата пероксидазы повышается с увеличением его чистоты.

Учитывая это, оптимальное количество альдегидных групп в структуре альгинатного волокна составляет 0,850,90 мас.7, а содержание альбумина

11-13 мг/г сухого сорбента.

Результаты сорбции и десорбции окислительно-восстановительного фермента пероксидазы приведены в табл. 2.

Анализ данных табл. 2 показывает, что использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет получить препарат с удельной актив- 20 ностью 68,3 ед./мг, что в 2,2 раза выше, чем по известному способу, причем выход фермента по активности не снижается и составляет 81,17, при этом термостабильность пероксидазы значи- 25 тельно возрастает в сравнении с из— вестным способом.

Пример 13. Аффинный сорбент может быть использован многократно.

Результаты исследования альгинатного 30 волокна, модифицированного глутаровым альдегидом и альбумином в нескольких циклах сорбции и десорбции окислительно-восстановительного, фермента пероксидазы из КФ Cerrena maxima Nurr приведены в табл. 3.

I !

:Анализ данных табл. 3 показывает, что использование указанного волокна в нескольких циклах сорбции-десорб- 40 ции снижает выход препарата пероксидазы от цикла к циклу. Хотя свойства выделенной пероксидазы изменяются незначительно, использование сорб ента более чем в 7 циклах работы нецелесообразно с экономической точки зрения, 16 о так как выход препарата значительно снижается.

Характеристика прочностных свойств модифицированного альгинаторного волокна изменяется несущественно, что позволяет рекомендовать его для проведения регенерации. Последнюю осуществляют путем обработки волокна

0,1 М HCI и альбумином. После регенерации работоспособность волокна по отношению к пероксидазе восстанавливается, Физико-механические ."войства

l альгинатного волокна позволяют проводить три цикла регенерации (табл. 4) °

Из данных табл. 4 видно, что в четвертом цикле регенерации абсолютная разрывная нагрузка и относительное удлинение уменьшаются, вследствие этого волокно теряет способность к формоу стойчивости.

Учитывая возможность регенерации, альгинатное волокно, модифицированное глутаровым апьдегидом и альбумином можно использовать в 4к7=28 циклах сорбции пероксидазы из КФ Cerrena

maxima Иигг.

Формула изобретения

Способ выделения пероксидазы из культурального фипьтрата базидиального гриба Cerrena maxima Hurr, включающий взаимодействие культурального фипьтрата с волокнистым сорбентом с последующей десорбцией фермента уксусно-ацетатным буфером, о т л и ч аI ю шийся тем, что, с целью повышения удельной активности, чистоты препарата пероксидазы и его термостабильности с сохранением суммарной активности фермента, в качестве волокнистого, сорбента используют альгинатное волокно, содержащее 0,85-0,90 мас.Ж .альдегидных групп глутарового альдегида и 10-13 мг апьбумина на 1 г .сухого сорбента, )6293)6 и!

Д l (1

И о а

«tl (»

О

СО лс r л сО сО со а л а а оооо («« св(° в

О (а м

U w о с( и Q йГ, I о (с

В с о

1С ьГ

О

«:О

QCt ."

«J g lO

> о

333

Вэ а

g аа и л о м а еь а а с (с(с

«е а а 5 а а а а агьла

1

K а

Ц о

0 а а у(1 и Св

Ц у а

О I

1

I (4

О

cd ж о

Ф

I l I 1 !

О О (I

1 I I I I I

«Ч

«а

1

Х

g а с

1 о

I Ж

А

3 о

«d (а

«) а о л а и

«((о

I.

1 Г

1 K

1 а

«((I с:(0

l

I 1 (о

I Э

Х

Ж «(( а Ов (» а «d

C О о с( (С E

1 I

1 t! о

1

I

t! о

СО

1 l

Л Л СО М с СО С0 ! аааеiолt r r

l О\ О л ««со М с/Ъ л (Л СO 00 СО СО О1 Ch Ch Ch О О Yl л мм

I а а л а В

ООООО с(О ллс(сол Мм а В б а еь а В еь а

«ч « О с(и О л со со М О1 О О во О 1О О 1

1 мсчаОcnO — ——

В В б а В ев а В а м л м щ «) ° л се ьО а л л СО 00 со

ООФООООО

Г

00 Оь О1 О С (О л О «Ч ссь л О1 О

Ch СО СО CO СО СО Ch ев а я В A еь o o

ОООООООО

Ю а Ф Ф л СО Ов « «

1629316

Ю

1 1» абой 3

g xw ы

Ы 3» Сс O с33-Ыс) сЧ

Ю

О л л с Ъ

О

ыое

О 33 ф 3»

)33 Ю О С» ф

Р

ы "ф с3 с32 о

1 3»

1Р

t 5. Ю ° .

3 ц A 3» Ф с Ъ

Ю сЧ л

Ю

О сЧ. л

C3 CV

)

I

t с Ъ с Ъ

N hl с ) сч

1 С) о 8

О

CO

O O с Ъ

1 331 о

i i:3 ф в I с Ъ

D о1

Ю

О оъ

Ф В

Ф О

1

I

1 и Ф

С) 1

Зо»

as x И

43

XC3X с»

3 сс) СЬ

t k

t !! м

l

В 2I

1а аи Ьа и ! ct t 5c) ьо ! 3C I 3 3 5 2К о,ссЪ л

O В

О ф ф

О О а В

О О

РЪ re

В В

cv с) 1 !

1

С3 1 Э 1 Ю 1 ь 1

О g Оы X 1 Î а Е О 3

С3, З а 3- сВ R X CS f а

5 а 4 3 5 5 i 3 33 5 t

I

1

1 !

1629316! !

0)g 1

Уе о о

I

I o

1 а

1

1 ) ! t 1

1 1 Cl

1 1 (1 Ia

Я»

I х

01 i !

1 и »!1 в в о

m л

° Ф »Ч о

»Ч <Ч

»Ч

»Ч л 0»

СЧ ФЪ о о

1

1

01

» О»0

» о Л и а 0» л

00 о

00 Ф

O O

Ф Ф

»0 а

1»а

I &

I0Мф0» а1 2 aI lo л сч а а

4Ч ф

1

1

I

I а

Х о

1 0»

1 Г4 о а а в

Ф 01

X I

aI al

Я а!

О Ц 0» сл»

1 о о о о м Л

СЪ

IO л

» о х о хо

v x мх

00 01

О 00 л

I »0! у х

1 i

°, Э ! !! j4l

CV (II) ф !

g Й

aII М мф 3

6 а j

1 ф

1

I

1 !

"Б

1 о

С» о

1 1

03 ,а

» f и о

1 al

1 Х ! Я о о

»

Э

I 0») Ф

16293! 6

13

Т аблица3

Цикл р або

Характеристика волокна

Характеристика пероксидазы

Изменение усадки волокна в буфере, Ж

АктивОт носительное

Термостабильность, % от исходной, при о темпер атуре, С

Выход, 7 от исходного ты ность ед/мг разрывное удлинение, Ж

80 90

П р и м е ч а н и е. Содержание альдегидных групп в волокне 0,90 мас.Ж содержание альбумина !3 мг/г.

Т абли ца4

Цикл Абсолютная разрывная нагрузка сН

От но сит ел ьное удлинение, Ж

2. 3

12,5

10 9

9,5

8,7

17,5

16,9 !

6,1

15,0

Составитель А. Семенов

Техред А. Кравчук.

Редактор Н. Гунько

Корректор М. Шароши

Заказ 410 Тираж 362 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101! 81,1

2 81,0

3 76,3

4 70,5

5 65,1

6 605

7 55,7

8 53,0

68,3

68,3

67,9

66,3

65,5

64,5

64;0

64,0

0,87 97

0,87 97

0,85 95

0,83 95

0,83 93

0,80 93

Оь 80 93

0,79 90

78

78

73

73

73

Аб солютная р аз рывная нагрузка, сН!

4,8 !

4,8 4,! !

3,5

13,0 !

3,0

12,5

12,0

19,7 !

9,7

19 ° 2 !

8,4

18,0

18,0

l7 5

17,3

5,4

5,4

5 4

5,4

5,4

5,4

5,4

5,4