Способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли

Способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии , в частности к способу очистки физиологически активного вещества., Способ заключается в том, что водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФИО, полученный генно-инженерным методом, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем., 8 табл

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СО1.1ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU» 1630602 (51)5 А 61 К 37/02, С 12 И 15/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Бег Бег Ser- Arg Thr ProSer Asp Lys Pro Val Ala His Ча1 Ча1

) Ala Asn Pro Gln Л1а Glu Gly Gln Leu Gln Trp Т,г.u Asn Arg Arg

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Чаl Glu Leu Arg Asp Asn Gln

Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

Lr u Phe Lya Gly Gln Gly Cxs Pro Ser Thr 11з.н Val Lcu Lcu Thr (21) 3985474/13 (22) 22.11.86 (31) 59-246184 (32) 22.11.84 (33) JP (46) 23.02.91. Бюл. Ф 7 (71) Асахи Касей Когио Кабусики

Кайся (Л. ) (72) Юнити Кадзихара, Такао Киета н Хироси Хаяси (1Р) (53) 575. 224. 2 (088. 8) Изобретение относится .к биохимии, в частности к способу очистки физиологически активного вещества, причем указанное физиологически активное вещество является веществом, полученным по методике с рекомбинантной ДНК с использованием рекомбинантной ДНК, содержащей ДНК, кодирующую вещество, которое обладает цитотоксической активностью против L-M клеток и способно индуцировать геморрагический некроз трансплантированной MetA саркомы в ВаЬ В/с мьппей.

2 (54) СПОСОБ. ОЧИСТКИ РЕКОИБИНАНТНОГО

ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способу очистки физиологически активного вещества.

Способ заключается в том, что водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, полученный генно-инженерным методом, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем., 8 табл.

Человеческий фактор некроза опухоли является веществом, полученным по традиционной методике с рекомбинатной ДНК, содержащей ДНК, кодйрующую ФНО, Человеческий ФНО проявляет цитотоксическую активность против L-M клеток и индуцирует геморрагический некроз трансплантированой Net А саркомы у BaL В/с мышей. Человеческий ФНО представляет собой полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

1630602

His Thr Ile Ser Arg Xle Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Х1е Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

С1у Я1а Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Х

Arg pro Asp Tyr Leu Asp phe Ala Glu Ser Gly Gln Ча1 Tyr Phe

Gly Ile Х1е Ala Leu . мированных плазмидой, кодирующей ФНО со следующей нуклеотидной последовательностью:

Человеческий ФНО, имеющий указан" ную аминокислотную последовательность, получают в результате культивирования итаммов Е.соТ1, трансфорTCA ТСТ TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA

ВСЯ ЛЛС ССТ СЛЛ GCT GAG GGG CAG СТС CAG TGQ CTG ЛЛС CGC CGG

GCC AAT GCC СТС CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT. AAC CAG

CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC СТС ATC TAC TCC CAG GTC

СТС TTC AAG GGC CAA GGC TGC ССС TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC

CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC

CTC СТС TCT GCC ATC AAG AGC ССС TGC САС AGG GAG АСС CCA GAG

GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG ССС ATC TAT CTG GGA GGG

GTC TTC CAG CTG GAG AAQ GGT GAC CGA СТС AGC GCT GAG ATC AAT

CGG ССС GAC TAT СТС GAC ТТТ GCC.GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT

GGG ATC ATT GCC CTG

Человеческий ФНО и указанную ДНК получают следующим образом„

Используют геномный набор (библиотеку) бактериофага пропилина и геном4> ный набор бактериофага человека. Ткани кролика или человека, например ткань поджелудочной железы кролика или человека, измельчают и обрабатывают, чтобы переварить ДНК и белковые ма50 териалы и получить при осаждении высокомолекулярную ДНК кролика или человека. Высокомолекулярную ДНК частично переваривают эндонуклеазами.

Полученные фрагменты ДНК фракцио—

55 нируют по размерам, получая фрагменты от 15 до 20 к. и. т., и клонируют, используя вектор Чарок 4А фага. Векторы упаковывают in vitro в частицы

sp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn заражающего фага, содержащие рДНК, и получают указанный геномный набор кролика или человека. кДНК ФНО кролика метят P-меченой эг вставкой, Каждый из геномных наборов бактериофаг/кролик и бактериофаг/человек помещают на пластины для фактического стечения массы бактерий и скринируют для гибридизации с P-меченой кДНК

ФНО кролика.

Из подходящих клонов изолируют соответствующую ДНК, определяют рестрикционные карты и анализируют по методу гибридизации Соутерна. Рестрикционные фрагменты, содержащие гены

ФНО кролика или человека, субклонируют в векторы, а затем секвенируют„

1630602

Основную последовательность кДНК ФНО кролика сравнивают с геном ФНО кролика для определения экзонов и интронов гена ФНО кролика. Сравнивают основную последовательность гена человеческого ФНО с основной последовательностью гена ФНО кролика для определения экзонов и интронов гена человеческого ФНО. Аминокислотную последовательность ФНО кролика, которая вычислена из основной последовательности, полученной делецией интронов гена ФНО кролика и сочетанием его азкенов, приводят в соответствие с аминокислотной последовательностью из

;основной последовательности кДНК ФНО ролика. Затем определяют аминокислотчую последовательность человеческого йНО, из основной последовательности

11НК, кодирующей человеческий ФНО, полученной делецией интронов гена, кодирующего человеческий ФНО, и объединением его экзонов. Кодируют человеческий ФНО в соответствующий вектор экспрессии для образования рекомбинантной ДНК, содержащей кодирующую

ДНК. Рекомбинантную ДНК используют для трансформации соответствующей клетки хозяина, что позволяет расти в культуре и экспрессировать желаемый человеческий ФНО. Полученный таким образом человеческий ФНО имеет

155 аминокислотных остатков в его зрелой форме, начиная с серина.

Водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, подвергают колоночной хроматографии, используя колонну, заполненную связанным с красителем сшитым агаровым гелем, Перед проведением колоночной хроматографии водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, частично очищают с использованием одной или сочетания традиционных биохимических методик, чтобы получить водный раствор, содержащий частично очищенный человеческий ФНО. В качестве подходящих биохимических методик для частичной очистки человеческого ФНО используют обессоливающую методику, в которой применяют сульфат аммония, ионообменную хроматографию для удаления белковых примесей, в которой применя-: ют анионообменную смолу, такую как

ДЕАЕ-Сефарозу, обработку водным раствором полимина P для удаления белковых загрязнений, методику гель-фильтрации, электрофореза и т.п. Раствор, содержащий физиологически активное вещество, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем. Водный раствор, содержащий физиологически активное вещество, включает как упомянутые водные растворы, содержащие неочищенный человеческий ФНО, так и водные растворы, содержащие частично очищенный человеческий ФНО.

Связанный с красителем сшитый агарозный гель приготавливают путем ковалентного связывания красителя в качестве лигнина со сшитым агарозным гелем. В качестве сшитого агарозного геля может быть применен любой сшитый агарозный гель, например Сефароза. В качестве красителя используют Цибакрон голубой ЕЗСА, Процион красный

НЕЗВ, Зеленый А.

Сшитые агарозные гели, связанные с красителем, являются коммерчески доступными. В качестве Цибакрона голубого РЗСА, связанного со сшитым агарозным гелем используют Блю Сафар розу CL-6В, Аффигель Блю, Матрекс

Гель Блю А и т.п. В качестве Проциона красного НЕЗВ, связанного со сшитым агарозным гелем, используют Матрекс Гель Ред А и т.п. В качестве

Зеленого А, связанного со сшитым агарозным гелем, используют Матрекс Гель

Грин А.

Указанным связанным с красителем сшитым агарозным гелем заполняют колонку и используют ее для колоночной хроматографии. Колоночную хроматографию проводят следующим образом.

Колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем, уравновешивают буфером, содержащим

0,1 M NaC1 (ph 5,5-6,5). В качестве буфера используют фосфатный буфер и т.п. В уравновешенную таким образом колонку наносят водный раствор физиологически активного вещества. Предпочтительно, чтобы величина рН водного раствора сырого физиологичЕски активного вещества была установлена равной 5,5-6,5. Затем колонку промывают тем же самым буфером. После этого проводят элюирование, используя в качестве элюента буфер, имеющий более высокую концентрацию хлористого натрия, чем в буфере, использованном для уравновешивания колонки, например буфер, содержащий 0,5 M или более NaC1.

1630602 люирование также проводят с использованием в качестве элюента буфера, имеющего величину рН 8,0 или выше, Таким образом получают фракцию, содер-. жащую человеческий ФНО.

Согласно предлагаемому способу человеческий ФНО попучают в чистом виде с высоким выходом. 10

Связанный с красителем сшитый агарозный гель, используемый в изобретении, является устойчивым к водному щелочному раствору и к теплу и, следовательно, может быть подвергнут обработке водным щелочным раствором, чтобы легко удалить пирогены, которые являются нежелательными примесями для фармацевтического применения, и может быть стерилизован в автоклаве.

Очищенный таким образом, человеческий ФНО обладает противоопухолевой активностью, в то время как он 25 не оказывает токсического действия на нормальиле клетки. В опыте in vivo используют Met А саркому, трансплантированную мьппам, при введении мыши

300 единиц очищенного человеческого 30

ФНО который получен согласно изобретению, его активность оценена как (+). Такж.. наблюдается значительное ингибироваиие роста или регрессия ра" ка после. введения очищенного человеческого ФНО по сравнению с контролем — мьппью, которой был инжектиро-. ван физиологический раствор, на мышах, которым трансплантирована. карцинома Колен 26. Оценяют цитоток- 40 сическую активность против различных раковых клеток очищенного человеческого ФНО так же, как в опыте

in vitro с тем исключением, что используют азенокарциномы РС-8 клетки 45 (рак легкого) и нормальные клетки (клетки почки новорожденного человека), и клетки крайней плоти новорожденного человека в качестве контроля вместо L-М клеток, клетки инкубируют при 37 С в течение 72 ч вместо 37 С в течение 48 ч.

Полученный человеческий ФНО обладает отличной противоопухолевой активностью,.Следовательно, полученный человеческий ФНО является особенно полезным при клиническом применении человеческого ФНО в качестве противоопухолевого лекарства.

Применяют аналитический метод для оценки противоопухолевой активностй человеческого ФНО., Способ оценки in vivo активности

ФНО. Трансплантируют клетки Met А саркомы (2 10 клетки) подкожно каж5 дой BAL B/с мыши. Через 7 дней отбирают для оценки мышей с опухолями диаметром 7-8 мм без геморрагического некроза и с хорошей васкуляризацией. Образец человеческого ФНО (0,5 мл), разбавленный физиологическим раствором, инжектируют через хвостовую вену каждой мьппи. Активность образца оценивают через 24 ч по следующим критериям: (-) нет изменений; (+) слабый геморрагический некроз; (+): умеренный геморрагический некроз (центральный некроз, распространяющийся приблизительно на 50% поверхности трансплантированной опухоли);(+ +): значительный геморрагический некроз (массивный иекроз в центре трансплантированной опухоли, составляющий маленький жизнеспособный ободок вдоль периферии опухоли).

Способ оценки in vitro (аналитический метод с использованием L-M клеток).

Образец (0 1 мл) человеческого

ФНО, серийно разбавленный средой, и суспензию L-M клеток (0,1 мл, 1.10 клеток/мл) прибавляют в каждое углубление ЯС-камерной пластины микротитратора. В качестве среды используют минимальную основную среду Мгла содержащую 10% обьем/объем сыворотки новорожденного теленка. Пластины инкубируют при 37 С в течение 48 ч в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. В конце периода культивирования прибавляют 20 мкл 20%-ного водного раствора глутарового альдегида для фиксации клеток. После фиксации пластины промывают и дают им высохнуть и прибавляют 0,1 мп 0,05/ного раствора метиленового голубого для окраски жизнеспособных клеток.

Пластины тщательно промывают для удаления избытка метиленового голубого и дают им высохнуть. Затем в каждую ячейку добавляют 3%-ную соляную кислоту, чтобы экстрагировать метиленовый голубой из окрашенных клеток. Измеряют абсорбцию каждой ячейки при

665 нм. Абсорбция пропорциональна числу жизнеспособных клеток. Разбавление человеческого ФНО, которое соот1630602

l0 ветствует абсорбции вещества, равной

50 от абсорбции контрольной группы, в которую образец человеческого ФНО не был добавлен, получают графически

5 или путем расчета. Разбавление определяют как одну единицу мл.

Пример 1. Самкам кроликов, весящим 2,0-3,0 кг, инжектируют 50мг убитых Формалином P ropionibac terium acnes (Corynebac ter ium parvum) через ушную вену. Спустя 8 дней снова инжектируют ч ер ез ушную вену 100 мкг эндотоксина (липополисахарид из Escherichia coli 026:36), а через 2 ч собирают цельную кровь из сердца. К собранной крови добавляют гепаринат натрия в количестве 100 единиц на

100 мл. Затем кровь центрифугируют при охлаждении при 5000 об/мин в течение 30 мин для удаления клеток крови и нерастворимых твердых продуктов.

В результате получают плазму (2,4 л), имеющую цитотоксическую активность

ФНО сыворотки 3 10 ед/мл, от .40 кро4. ликов, К 2,4 л плазмы прибавляют 24 г целлита, Полученную смесь перемешивают 1 ч, а затем фильтруют. Фильтрат смешивают с 1,2 л 0,04 M транс-НС1буфера (рН 7,8), а затем наносят на колонку с ДЕАЕ-Сефарозой CL-6B, уравновешенной 0,04 M транс-НС1-буфером (рН 7,8), Колонку промывают 0,04 И трис-НСl-буфером, содержащим 0,1 М

NaC1 а адсорбированный ФНО элюируют, используя 0,04 И трис-НС1-буфер (рН 7, 2), содержащий 0,18 И NaC1. Фракции, обладающие цитотоксической активностью против Ь-клеток,концентрируютультрафиль- 40 трацией, Полученный таким образом концентрат наносят на колонку с Сефакрилом 8-200, уравновешенную 5 ьИ фосфатным буфером, и гель фильтруют,, используя тот же самый буфер. Активные 4 фракции концентрируют ультрафильтрацней, в результате чего получают очищенный ФНО, имеющий активность 3,5» 10 ед. и удельную активность 19 х

Х10 ед/мг.

Частично очищенный ФНО из сыворот- 0 ки кролика смешивают с полным адъювантом Фрейнда (1:1), а затем подкожно инжектируют в спину 12-недельным . самцам мышей BaL В/с. Повторяют опи, санную операцию через 2 и 4 недели после первой инъекции. Через неделю после последней инъекции собирают цельную кровь. Из собранной крови получают сыворотку, Полученную таким образом сыворотку прибавляют к культуральной среде для оценки цитотоксической активности ФНО против L-клеток в таком количестве, чтобы она была разбавлена в 500 раз в конечной концентрации.

Оценивают цитотоксическую активность

ФНО сыворотки кролика против L-клеток. ФНО сыворотки кролика не обла-. дает цитотоксической активностью против L-клеток. Из приведенного результата делают вывод,что мышиная сыворотка, полученная на этой стадии, содержит антитело и ФНО из сыворотки кролика.

Самкам кроликов внутривенно инжектируют убитые формалином клетки Propionibacterium аспез (Corynebacterium parvum). Семь дней спустя кролика подвергают трехеотомии и промывают легкое физиологическим раствором, в результате получают плавающие клетки.

Полученные таким образом клетки промывают физиологическим раствором. Используя в качестве культуральной среды Phun 1640, содержащей 10Х объем/

/объем сыворотки новорожденного тео ленка, клетки инкубируют при 37 С в атмосфере, содержащей 51 двуокиси углерода. Культуру клеток разделяют на

3 группы и в одну из них добавляют эндоксин, происходящий из Escherichia

coli (липополисахарид из Escherichia

coli 026:В6) в концентрации 10 мкг/мл.

В другую добавляют такое же количество стерильной воды. Надосадочный слой культуры клеток, к которой добавлен эндотоксин, проявляет цитотоксическую активность против Ь-клеток, и активность достигает максимальной величины за 7 ч. Такая активность подавляется антителом анти-ФНО, но не подавляется нормальной сывороткой мышей.

С ppyroA стороныу надосадочныи слой клеточной культуры, к которой не был добавлен эндотоксин, не проявляет цитотоксической активности против L-клеток.

К культуре клеток, к которой добавлен эндотоксин, затем добавляют радиоактивный L (5 ) метионин (13000 Ки/ммоль) (1 мКи/мл). Надосадочный слой анализируют электрофорезом на СДС-полиакриламидном геле

Концентрацию геля устанавливают

12,5 мас.X. После электрофореза гель обрабатывают ENHANCE и после окра1630602!

2 шивания экспонируют на рентгеновскую пленку. В надосадочном слое культуры клеток в присутствии эндоксина наблю- дают что образуется вещество имеюЭ

5 щее мол.м. около 17500.

Далее надосадочный слой каждой полученной культуры клеток подвергают электрофорезу на "ДС-полиакриламидном геле. После этого гель встряла !О кивают в течение 1 ч в 2,5%-ном NP40 а затем в воде в течение 2 ч. После встряхивания отделяют разрезанием каждую линию миграции и разрезают на отрезки шириной 2 мм в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Каждую полоску культивируют с клетками и оцениваит цитотоксическую активность против L-клеток. В полосе, на которой надосадочный слой культуры клеток, содержащей эндотоксин,проявляется цитотоксичная активность против L-клеток в положении, соответствующем мол.м. 17500. В других положениях не наблюдается цитотоксич- 25 ности

Культуру клеток инкубируит в течение 2 ч после добавления эндотоксина, затем центрифугнруют для сбора клеток. Проводят экстракцию цитоплазматической PHK из собранных клеток и экстракцию мРНК из цитоплазматической РНК. Прибавляют 4 мл 4 М раствора гуанидиатиоцианата к 3 10 клеток, смесь .распыляют с помощью гомогенизатора, остатки извлекают центрифугированием и растворяют 2,4 r хлористого цезия. Смесь осторожно выливают в полномерную трубку, в которую заранее помещены 2,5 мл 5,7 M хлористо- 40

ro цезия и 0 1 мл раствора ЭЛТА (рН 7,5), а затем проводят ультрацентрифугирование при 30000 об/мин о в течение 12 ч при 20 С, используя ротор Неммана.

После удаления надосадочного слоя шарик растворяют в 1 мл 10 мМ буфера трис-НС1, содержащего 5 мМ ЭДТА и

1 мас.% объем СДС. Полученный раствор экстрагируют 4:1 по объему смесью хлороформа и 1-бутанола. К водной фазе прибавляют 0,05 объема 2 M ацетата натрия и 2,5 объема этанола, от0 стаивают при -20 С в течение 2 ч или более, в результате осаждается РНК.

Осадок собирают центрифугированием, 55 сушат, а затем растворяют в 500 мкл стерильной воды. В результате получают цитоплазматическую РНК.

Полученный раствор РНК нагревают при 68"С в течение 2 мин, после чего быстро охлаждают. К раствору прибавляют 500 мкл двукратной концентрации

10 мМ трис-ЭДТА-буфера (рН 7,4), содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,1 мас.%/объем

СДС и 0,5 M хлористого лития),смесь наносят на 200 мг олиго-dT-целлюлозы, в колонке промывают 10 мл того же буфера (однократная концентрация).

Материал в колонке элюируют 2 мл элюирующего буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1-буфера (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА и 0,1 мас.%/объем СДС. К элюату прибавляют 0 05 объема раствора ацетата натрия и 2,5 объема этанола,смесь охлаждают до -20 С для осаждения. о

Осадок собирают центрифугированием и наносят на колонку с олиго-dT-целлюлозой, собирают фракции, адсорбированные в олиго-dT-целлюлозе. Извлекают 85 мкг мРНК, что определено с помощью УФ-спектрального анализа.

Растворяют 880 мкг мРНК в 250 мкл воды и полученный раствор наливают в

10 мл 5-25%-ного линейного градиента сахарозы по плотности. Градиент плотности сахарозы получают с помощью

ТБСО 570 гадиентера, используя трисбуферные растворы (содержание 25 мМ трис-НС1 рН 7,2, 2 мМ ЭТА и 1 мас.%/

/объем СДС), содержащие соответственно 5 и 25% сахарозы.

Проводят ультрацентрифугирование, используя ротор Бекмана Sn41, при

40000 об/мин в течение 12 ч при 4 С, собирают фракции каждые 400 мкл с помощью устройства для сбора фракций, а затем осаждают этанолом. Осажденные фракции центрифугируют и растворяют в стерильной воде.

Проводят трансляцию иРНК, используя социты Хепорцз laeves, фракционированную мРНК растворяют в стерильной воде до получения концентрации

1 мкг/мкл,ижкектируют раствор в социты в таком малом количестве, как

500 мл на клетку. Затем клетки культивируют в течение 24 ч в растворе

Барта (содержащем 7,5 мМ трис-НС1 рН 7,6, 88 мМ NaC1 1 мМ хлористого калия, 0,33 мМ нитрата кальция, 0,41 мМ хлористого кальция, 0,82 мМ сульфата магния, 2,4 мМ бикарбоната натрия, 13 И/мл пенициллина G u

18 мкг/мл стрептомицина), который содержит 1 мг/мл сывороточного бычье1630602

14 го альбумина. Осциты размещают в жидкой культуре стеклянной палочкой.

Жидкую культуру затем центрифугируют и оценивают надосадочный слой на ци5 тотоксическую активность против Lклеток. мРНК, которая должна быть транслирована, для получения полипептида, имеющего максимальную активность, седиментирует как 168 по размеру. Эта активность удаляется антителом анти-9НО но не удаляется нормальной сывороткой мышей, Используя 5 мкг фракционированной

15 мРНК, готовят двунитевую ДНК. Двунитевую ДНК фракционируют по размерам на 3,5%-ном полиакриламидном геле, получают 330 нг, примерно от 100 до 200 пар оснований. 7 нг этой фракции наращивают деоксиостатками, используя терминальную деоксилуилеотнлдилтрансферазу и отжигают 56 нг плазмиды pBR 322, которая была переварена Pst 1 и нарощена деокси -G-остатками.

Полученную смесь вставляют Е.coli

К-12 (штамм НВ 101, АТСС, 33964),чтобы трансформировать штамм, В результате получают 12000 трансформантов.

ФНО кролика (активность: 5 10 единиц) подвергают электрофорезу на СДСполиакриламидном геле, Часть геля окрашивают Кумасси Бриллантовым голубым. Полосу в положении, соответствующем мол.м. 17500, вырезают из

35 геля и экстрагируют 1%-ным бикарбонатом аммония. Извлекают около 180 мг

ФНО в виде белка.

Растворяют 150 мкг извлеченного

ФНО в 75 мкл 1%-ного бикарбоната аммония, затем добавляют 3 мкг ТРСК о трипсина. Смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч. Затем смесь фракционируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонне, заполненной Космосилом 503 в качестве насадочного материала, чтобы в результате получить фрагменты, переваренные трипсином.

Высокочистый ФНО и его переваренные трипсином фрагменты .-затем подвергают обессоливанию на колонке с Сефадексом G-25 и сушат с замораживанием.

Очищенные ФНО и переваренные трипсином фрагменты каждые подвергают разложению Эдмана из N-терминала. Высвободившуюся на каждой стадии PTHаминокислоту анализируют традиционным методом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, модель

SP 8100 обнаруживает, что ФНО имеет следующую N-терминальную аминокислот-. ную последовательность: Ser-Ala-Sez-Arg-Ala-Leu-,Ser-Азр-Lys-Pro-Leu-Ala-Hes-Val-Val-Ala-Ala-Asn-Pro-Glu-Va1-Glu-Gly-Gln-Leu -Glu.

Один из переваренных трипсином фрагментов имеет следующую N-терминальную аминокислотную последовательность: Glu — Thr — Pro Glu Glu Ala

Glu Pro Met Ala.

Олигодеоксинуклеотиды, комплиментарные основной последовательности мРНК, синтезируют согласно усовершенствованной фосфотриэфирной методике. При получении олигодеоксинуклеотидов 128 олигодеоксинуклеотидов, определенных из аминокислотной последовательности ФНО кролика, классифицируют на пять групп, а именно группы 16,16,32,32 и 32, и синтезируют в виде смеси олигодеоксинуклеотидов соответствующих групп. Осуществляют защиту у полученных олигодеоксинукле" отидов соответствующих групп согласно традиционной методике и очищают колоночной хроматографией, используя Сефадекс -50 и электрофорез на

20%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 M мочевины.

Полученные таким образом олигодеоксинуклеотиды соответствующих групп диализуют против О,! мМ трисЭДТА буферного раствора.

Каждый из очищенных олигодеоксинуклеотидов соответствующих групп метят, используя Т полинуклеотиднинезу и P-аденозинтрифосфат, а затем очищают колоночной хроматографией.

Радиоактивный материал включают в каждый из нуклеотидов соответствующих групп в количестве около 3 > 10 кпм/мкг. Олигодеоксинуклеотидные зонды, каждый полученный в виде смеси соответствующей группы, обозначены, как показано в табл.1.

Часть аминокислотной последовательности ФНО кролика, основная последовательность мРНК, определенная из аминокислотной последовательности

ФНО кролика, и основные последовательности синтетических олигонуклеотидных зондов соответствующих групп приведены в табл.1.

1630602

20 ры экспонируют на рентгеновскую плен- 25 полученные при расщеплении соответстОбрабатывают мРНК клеток, продуцирующих ФНО, раствором, содержащим

1 М глиоксаля, 10 мМ NaH P04 и 50 об.% диметилсульфоксида, при 50 С в течение 60 мин, а затем подвергают фракционированию, используя электрофорез на 1,1%-ном агарозном геле. Фракцио" нированную мРНК переносят на фильтр переносящего устройства электрофоретического типа. Затем мРНК на фильтре устройства обрабатывают 5 < Денхардт с раствором, содержащим 5«SSC раствор и 150 мкг/мл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося, при

65 С в течение 2 ч, а затем обрабао тывают 5 v Денкардт с раствором со7

Э держащим l ° 10 кпм/мл, меченых, олигодеоксинуклеотидов и 5 х SSC расто вор, при 50 С в течение 2 ч. Полученный осадок на фильтре промывают

6 У SSC раствором последовательно четыре раза при комнатной температуре, о при 40,,50 и 60 С. Облученные фильтку XAR-5 ° В результате обнаруживают, что олигодеоксинуклеотиды, обозначенные как зонд MJ сильнее гибридизируется с мРНК.

Трансформанты переносят на целлюлозный фильтр и гибридизуют ДНК с меченым олигодеоксинуклеотидом (зонд

MJ) в тех же самых условиях, что в примере 12. Отбирают 49 колоний, которые сильно гибридизуются с меченными олигодеоксинуклеотидами (зонд

MJ) а затем фиксируют на другом нитроцеллюлозном фильтре. Затем, используя 49 колоний, проводят дальнейшую гибридизацию, чтобы отобрать девять колоний„ которые более сильно гибридизуются с меченными олигодеоксинуклеотидами (зонд MJ).

Получают примерно 5 мкг плазмиды из каждой из девяти колоний, Каждую из полученных плазмид расщ<епляют, используя растрикционные ферменты

Pst Х, Tag I Rsa I u Pvu II, затем проводят электрофорез на 1%-ном агарозном геле и сравнивают фрагменты, вующими рестрикционными ферментами, по их длине.

Результаты подтверждают, что все девять штаммов соответствующих девяти колоний содержат фрагмент, получаемый при расщеплении Pv« II u Rsa I, размером 50 п.о., и что большинство

55.из девяти штаммов имеют фрагмент, полученный расщеплением RsaI размером 200 п„о. Другими словами, результаты подтверждают, что девять штаммов имеют частично общие основные последовательности.

Раздельно культивируют семь штаммов, содержащих плазмиды, приведенные в табл.2, в 2 мл ЛБ-среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, до тех пор, пока оптическая плотность растворов не достигнет заданной величины, затем центрифугируют для получения соответствующего штамма.

Каждый из полученных штаммов отдельно добавляют в 2 мл физиологического раствора и разрушают озвучиванием. Полученные растворы центрифугчруют и определяют цитотоксическую активность против L-клеток полученных надосадочных слоев. В качестве контрольного теста повторяют ту we самую процедуру, используя штаммы, содержащие плазмиду рВК 322.

Подавляют цитотоксическую активность против I-клеток с помощью антитела анти-ФНО.

Культивируют штаммы Е.coli содержащие плазмиды рВК2-7 и pBR 18, в 1 л среды М9 содержащей 10 мкг/мл тетрациклина.

Определяют основную последовательность вставки каждой плазмиды в соответствии с химической процедурой

Максам-Диилберта. Определенная таким образом основная последовательность находится в согласии с частичными аминокислотными последовательностями, определенными в примере 9..

На этой стадии проводят конструирование плазмиды, используя рекомбинантную плазмиду pR 12, для получения прямой экспрессии ФНО в Е.cali используя 2а в качестве промотора.

Сначала переваривают 10 мкг плазмиды

pR 12 10 ед.Ара1 при 37 С в течение

2 ч, затем проводят электрофорез на

4%-ном полиакриламидном геле, чтобы выделить фрагменты 630 п.Оо Изолируют электроэлюцией из геля около lмкг фрагмента. Синтезируют дваолигодеоксинуклеотщ а:САТССАТСТСАССТТСТСССССС-3 . Ф и 5 -ССАЬАА(3СТ6АСАТС-3 .Затем фосфорилируют каждый 5 -конец олигодеоксинуклеозидов (около 100 ммоль), используя Т ц полинуклеотидиназу. После завершения реакции экстрагируют реакционную смесь фенолом, а затем

-8

17

1630602 хлороформом. Затем смешивают полученные синтетические олигомеры с 0 5 мкг

ApaI фрагментом 630 п.о. и осаждают этанолом. Фрагмент лигируют с синтео 5 тическими олигомерами при 4 С, используя 10 ед. Т ДНК-лигазы. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этейолом и перемешивают с

20 ед. Baml при 37 С в течение 3 ч, затем проводят электрофорез на 4/ном полиакриламидном геле для извлечения электроэлюцией фрагмента 670п.о, Переваривают 1 мкг плазмиды pUC-8 с помощью BamHI и экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, затем осаж-дают этанолом для получения вектора

Связывают 0 5 мкг полученного вектора с полученным фрагментом, имеющим

BamHI участок на обоих концах, содер- 20 жащим около 670 п,о, и кодирующим

ФНО, используя Т4 ДНК-лигазу, Трансформируют Е.cali используя полученный вектор, и культивируют на агаровой среде, содержащей 1 мМ ИПТГ и 25

0,004 мас.Х/объем Х-гал для получения около 200 белых колоний. Выделяют плазмиду ДНК из 100 таких трансформантов и переваривают ВашНЕ. В результате выявлено, что 15 плазмид со- 30 держат указанный BamHI фрагмент (около 670 п.о.), Дпя того, чтобы исследовать направление вставки, переваривают более 15 плазмид EcoRI, имеющих только один распознаваемый участок на его pUC-8, и 11 плазмид, имею35 щих только один распознаваемый участок на его участке фрагмента (примерно 670 п.о.), проводят электрофорез на 6/-ном полиакриламидном геле. 40

В результате определяют, что 7 плазмид имеют указанный фрагмент, состоящий из примерно 140 п.о., и что направление транскрипции Еас промотора Hà pUC-8 находится в соответствии 45 с тактовым для олигодеоксинуклеотидов, кодирующих ФНО.

Анализ последовательности ДНК показывает что эти семь плазмид имеют ту же самую последовательность и имеют желаемую нуклеотидную последовательность при -сопоставлении с lac-промотором синтетической ДНК и кДНК.

Конструирование других плазмид проводят с использованием плазмиды

pR 17, чтобы получить прямую экспрессию ФНО в Eocoli используя lacUV-5 в качестве промотора. Сначала переваривают 10 мкг плазмиды pR 1710 ед.

ApaI при 570С в течение 2 ч, проводят электрофорез на 4 -ном полиакриламидном геле, чтобы выделить фрагмент, состоящий из примерно 630 п.о. Электроэлюцией выделяют около 1 мкг фрагмента. Таким же образом, как в стадии 10, синтезируют два олигодеоксин клеотида:5:-ААТТСАТСТСАССТТСТСССССС3 и5 -CGAGAAGCTGACATG-3 . Затем фосфорилируют каждый 5 -конец обоих олигодеоксинуклеотидов (около 100 пмолей) используя ТЧ полинуклеотидкиназу.

После завершения реакции экстрагируют реакционную смесь фенолом, а затем хлороформом. Затем смешивают синтетические олигомеры с 0,5 мкг заранее полученного ApaI фрагмента (около

630 п.о.), полученного из плазмиды

pR 17 и осажденного этанолом. Фрагмент лигируют с синтетическими олигомерами при 4 С в течение ночи, исо пользуя 10 ед.ТЧ. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом и переваривают 20 ед.EcoRI при 7ОС в течение 3 ч. Затем проводят электрофорез на 4%-ном полиакриламидном геле, чтобы извлечь фрагмент (около 670 п.о.) с помощью электро3 JlIOIJии о

Получают плазмиду рОР95-15.

Переваривают l мкг рОР95-15 с помощью EcoRI и экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, потом осаждают этанолом, чтобы получать вектор.

Используя Т ДНК-лигазу, связывают

0 5 мкг вектора с фрагментом (около

670 п.о.), полученным при связывании синтетического олигонуклеотида с олигонуклеотидом, кодирующим ФНО. Трансформируют Е,coliJN101 (АТСС 33876), используя полученный вектор, и культивируют на среде, содержащей 1 мМ

ИПТГ и 0,004 мас. ./объем Х-гал, чтобы получить примерно 150 белых колоний.

Готовят плазмиду ДНК из 100 этих колоний и переваривают EcoRI. В результате обнаружено, что 12 плазмид содержат заданный EcoRI фрагмент (около 670 п.о ). Для того, чтобы проверить направление вставки, переваривают более 12 плазмид PVUH иРз Е и проводят электрофорез на 1,5%-ном агарозном геле. В результате определено, что четыре плазмиды имеют желаемые фрагменты (около 1280 п.о. и около 2600 п.о.) и что направление транскрипции lac UV5 промотора

1630602

19

Число мьш ей, которые полностью избавились от опухоли

Число мьией, использованных в испытании согласуется с таковым олигодеоксинуклиотидов, кодирующих ФНО.

Анализ основной последовательности показал, что эти четыре плазмиды имеют ту же последовательность, что и lac UV5 промотор, синтетические олигодеоксинуклеотид и кДНК должным образом объединены друг с другом.Полученные плазмиды обозначают pTNF—

lас UV.5-I.

Культивируют штаммы Е.coli содержащие плазмиды, полученные в примере 16, в 50 мл ЛБ-среды, содержащей ампициллин, в течение ночи. Затем штаммы переносят на 5 л ЛБ-среды, содержащее 100 мкг/мл ампициллина, и продолжают культивировать при 37 С в течение 3 ч. Добавляют туо да изопропил Р -Д-тиогалактопираноPезультаты показаны в табл.3.

Пример 2. Колонии Е.coli К-I 2 ) штамма МС1061 трансформируют каждой из pR18, рВ 2-7, рН 2-2 плазмид. Вчастности, колонии Е. coli К 12 штамм . NG1061 культивируют на ЛБ-среде до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона не достигнет 0,3 при 550 мм. Собирают 50мп выросшей культуры Е. coli, про- мывают 25 мл смеси, содержащей 10 мМ

МОПС (рН 7,0) и 10 MM КвС1 и снова суспен- дируют в смеси, содержащей 0,1 М МОПС (рН

6,5), 50 мМ СаС1, и 10 мМКвС1. Полученную| суспензию охлаждают на льду В тече 40 ние 30 мин, центрифугируют и суспендируют в 2 мл смеси, содержащей 0,1 M

МОПС (рН 6,5), 50 мМ СаС1 и 10 мИ

ВвС1 и 30 мкл ДМСО. К 200 мкл (аликвота) полученной суспенвнн отнепвно прибавляют 1О мкл раствора ДНК каждой плазмнды, Каждую из полученных смесей охлаждают на льду в течение 30мин, а затем нагревают в течение 60 с при

44 С, Сразу после этого добавляют

5 мл предварительно подогретой до

37 С ЛБ-среды к каждой из нагретых о смесей, затем инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Полученный культуральный бульон центрифугируют для образования шариков клеток. Надосадочный слой

- 55 отбрасывают, добавляют ЛБ-среду и пе" ремешивают для повторного суспендирования каждого из клеточных шариков. зид до конечной концентрации 1 MM.

Продолжают культивирование еще 6 ч, затем охлаждают. Затем штаммы собирают центрифугированием. Штаммы вносят в 5 л 0,04 м трис-НС1-буферного раствора (рН 7,8) и разрушают озвучиванием, чтобы получить раствор белка штамма. Полученный раствор обладает цитотоксической активностью против Ь-клеток 5-10 ед/л.

Раствор очищают, чтобы получить

1,2 10 ед/ФНО. Удельная активность

ФНО составляет 6,8-10 ед./мг.

Образец (0,2 мл) ФНО подвергают оценке в анализе in vivo.

Через 20 дней после инъекции образца наблюдают за развитием опухоли и определяют дозу извлечения по следующему уравнению:

Каждую из полученных суспензий инокулируют на пластину с ЛБ-агаром, содержащим 30 мкг/мл тетрациклина, затем инкубируют в течение ночи при.

37 С. В результате получают колонии устойчивых к тетрациклину трансформантов, каждый из которых трансформирован плазмидой pR 18 ° рВ 2-7 или рВ2-2.

Каждый из трансформантов, трансформированный плаэмидами рВ 2-7 или

pR 18, выращивают и амплификации плазмиды собирают, лидируют трансформанта и сушат плазмидную ДНК, Иллюстративно устанавливают, что каждый из трансформантов инокулируют в ЛБ-среду, содержащую 30 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют при 37 С при энергичном встряхивании. Эту стадию повторяют, чтобы достичь роста трансформанта и амплификации плазмиды. Культивированный трансформант собирают центрифугированием при 4000g в течение 10 мин при 4 С. Надосадочнйй слой отбрасывают. Полученный шарик промывают в 100 мл охлажденного льдом

GTE (0,1 M NaC1, 10 мМ трис-HCl рН7,8 и 1 мМ ЭДТА), проводят лизис при кипячении в растворе 20 мг/мл лизоцима в 10 мМ трис НСl рН 8,0. Вязкии продукт переносят в трубку ультрацентрифуги и центрифугируют при

21

22

1630602

25000 об/мин в течение 30 мин при

4 С.для получения раствора ДНК. Измеряют объем раствора ДНК. На каждый

1 мл добавляют точно 1 г тве