Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника

Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к области .биотехнологии, в частности к ферментной отрасли микробиологической промышленности и представляет собой Iштамм Echerichia соН вкм СК-297Д способный одновременно продуцировать внеклеточную щелочную фосфатазу и накапливать внутриклеточно ее предшественник . Штамм получен трансформацией клеток E.coli K-12 802 рекомбинантной плазмидой, рН 1-7. Выход фосфатазы 8 мг/л, предшественника 0,5 мг/л.

ССЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ1632975

А1 (51) С 12 N 9/14, 1/20, 15/55

КЫОИ8ИР

- """-" "" -(у ааз

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4495706/13 (22) 18. 10.88 (46) 07.03.91. Бюл. Р 9 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Кубанский государственный медицинский институт им. Красной Армии (72) М.А; Несмеянова, М.И. Манувахова, F..Т. Федотикова и И.M. Цфасман (53) 577.15 (088.8) (56) Патент М 86 04 089, кл. С 12 N 15/00, опублик. 1935. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

COL I — ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ЩЕПОЧНОЙ

ФОСФАТАЗИ И EF, ПРЕДНЕСТВЕННИКА

Изобретение относится к области . биотехнологии, в частности к ферментной области микробиологической промышленности, и касается нового штамма-продуцента, который может . бьггь использован для одновременного получения внеклеточной щелочной фосфатазы и ее внутриклеточного мембраносвязанного предшественника.

Цель изобретения — получение штамма, обладающего способностью продуцировать одновременно внеклеточную щелочную фосфатазу и ее предшественника.

Предлагаемый штамм Е.coli ВКМ

CR-297Д продуцирует внеклеточную щелочную фосфатазу с выходом, соответствующим лучшим известным продуцентам внекп еточ ног о фермента, что позволяет его вьдепять из культуральной среди. Одновременно он продуциру2 (57) Изобретение относится к области . биотехнологии, в частности к ферментной отрасли микробиологической промышпенности и представляет собой штамм Echerichia соli ВКМ СК-297Д способный одновременно продуцировать внеклеточную щелочную фосфатазу и накапливать внутриклеточно ее предшественник. Штамм получен трансформацией клеток Е.cali К-12 802 рекомбинантной плазмидой, рН 1-7. Выход фосфатазы 8 мг/л, предшественника 0 5 мг/л. ет значительное количество внутриклеточного предшественника щелочной фосфатазы, который локализован в мембранной фракции и может бьггь вьделен из а биомассы после отделения от нее куль- ф ) туральной среды. СО

Штамм Е. coli ВКМ CR-297Д полу- Щ чен трансформацией клеток Е col i Ж

К-12 802 с диким Фенотьпом по pho регулону и lky области рекомбинантной ©1 плазмидой рН 1-7. Данная плазмида,производная от плазмиды pBR 322, содержит ген устойчивости к ампициллину и

HpaI-XhoI фрагмент (2,8 кв), несущий регуляторную и структурную области гена щелочной фосфатазы. В качестве реципиента рН 1-7 плазмиды использован штамм E. cali К-12 802 г m

lас supE, 11тамм Езсherichia col i ВКМ CR297Д характерезуется следующими свойствами.

16329 75

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, неспоровые.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на глюкозоминеральной среде, содержащей в 1 л, г: NaC1 4,68; КС1 1,49; NH

М $04 О, 1; СаС120,04, Ыа2804 0,099;.

ГеС1> 0,0022, трис 6; глюкоза 10; . 10 ортофосфат 1 мМ, тиамин 1 мг; пелтон

0,08Х, При росте на жидких средах, в том числе на МПБ или LB-бульоне, образуют ровную интенсивную муть.

При росте на мясо-пептонном агаре образуют округлые, гладкие с ровными краями, выпуклые, б есцветные колонии.

Физиолого-биохимические признаки ..

Клетки растут при 37 С, оптимум рН 7,5-7,8. В качестве источников углерода используют глюкозу, не усваивают лактозу. При росте в глюкозоминеральных средах требуют 20 мкг/мп метионина.

Устойчивость к антибиотикам.

Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плаэмиды рН 1-7 с ампициллиновым геном. Растет в присутствии 20 мкг/мп ампициллина.

II р и м е р. Культивирование штам- 30 ма BKN CR-297Д проводят на жидкой глюкозо-минеральной среде с добавлением 0,08 пептона, 0,5 мМ ортофосфата и 20 мкг/мп ампициллина с азраа цией, при t = 37 С. При посеве

105 клеенок/мп в медицинских колбах объемом 0,7 л в 200 мп среды за 5 ч культивирования при интенсивной аэрации на качалке со скоростью

120 об./мин культура достигает экспо- 40 ненциальной стадии роста. Затем культуру разбавляют в соотношении 1/20 свежей средой того же состава, но без ортофосфата и культивирование продолжают еще 15 ч. Через ч 4 инку- 4 бации достигается максимальная актив— ность внутриклеточной щелочной фосфатазы 0,07 Е/мп, удельная активность лг0,5 Е/мг белка.

При последующем культивировании начинается секреция щелочной фосфата50 зы в культуральную среду. Максимальное содержание фермента в среде достигается через 15 ч, когда он составляет 84Х. от всего синтезированного фермента и является преобладающим белком культуральной жидкости. Максимальная активность щелочной фосфатазы в среде составляет 0,16 Е/мп, внутриклеточной О, 03 Е/мп. Удельная активность 4 E/ìã белка. В то же время клетки содержат значительное количество предшественника, который локализован в мембранах. Его содержание в этом компартменте не меняется в течение всего периода секреции щелочной фосфатазы в культуральную среду.

Определение активности внеклеточной фосфатазы проводят стандартным методом по скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата ° 3a единицу фосфатной активности принимали количество фермента, которое гидролизует 1 мкмоль субстрата (и-нитрофенилфосфата) в мин. Анализ содержания внеклеточной щелочной фосфатазы и мембраносвязанного предшественника с помощью иммуноблотинга с использованием антител против щелочной фосфатазы показал, что выход внеклеточной фосфатазы составляет 8 мг/л, а предшественника

0,5 мг/л.

Внеклеточную щелочную фосфатазу выделяют из фильтрата культуральной жидкости, путем двухкратной фильтра- . ции культуральной среды через мембранные фильтры ХМ-100А и XM-50 в сочетании с тепловой обработкой, что позволяет добиться 99Х-ной чистоты фермента. Из клеток выделяют мембраны, их селективно солюбилиэуют и проводят очистку предшественника.

Таким образом, предлагаемый штамм

Е. cali ВКМ CR-297Д обладает способностью одновременно продуцировать внеклеточную щелочную фосфатазу и накапливать.внутриклеточно предшественник, что позволяет в одном процессе, используя как культуральную среду, так и клетки, выделять щелочную фосфатазу и ее предшественник.

Штамм стабилен прн культивировании и устойчив при хранении в различных условиях .

Формула изобретения

Штамм бактерий Eschcrichia coli

ВКМ CR-297Д . - продуцент внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника.