Способ селекционной диагностики зерна кукурузы на наличие гена опейк-2

Способ селекционной диагностики зерна кукурузы на наличие гена опейк-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к селекционногенетическим исследованиям кукурузы, и касается выявления онановых форм. Целью изобретения является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение и удешевление анализа. Способ состоит в том, что наличие гена Опейк-2, определяют по отношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при его значении до 4-5 идентифицируют исходную форму9 а при отношении свыше 5 - опаловую. 4 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

„.SU„„1642 6 (gg)g А 01 Н 1 04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ AEHT СССР

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4453319/13 (22) 01.07, 88 (46) 23, 04.91. Бюп. 1! 15(71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоединения Украины с Россией (72) А.Н. Винниченко, И.А. Филоник, Ю. В,Донченко, В.В,Мосолов и Н, Г,Задорожная (53) 578.085.23 (088.8) (56 ) Автор ское свидетельство СССР

N 1561223, кл. А 01 H 1/04, 1988. (54) СПОСОБ СЕЛЕКЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ

ЗЕРНА КУКУРУЗЫ HA НАЛИЧИЕ. ГЕНА ОПЕЙК-2

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть широко применено при массовой оценке селекционного материала на наличие гена

Опейк-2.

Целью изобретения является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение и удешевление анализов.

Способ состоит в том, что диагностику ведут по одному сортообразцу, при этом зерно кукурузы идентифицируют по соотношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при соотношении удельных активностей до 4-5 тестируют исходную линию, а при соотношении более 5 - мутантную форму с наличием гена Опейк-2.

2 (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционногенетическим исспедованиям кукурузы, и касается выявления онановых форм.

Целью изобретения является повышение точности и достоверности диагностики, упрощение и удешевление анализа, Способ состоит в том, что наличие гена

Опейк-2, определяют по отношению удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ингибитора химотрипсина и при его значении до 4-5 идентифицируют исходную форму, а при отношении свыше 5 - онановую. 4 табл., 1 ил.

В табл. 1 представлен состав смесей реагентов при построении калибровочного графика определения белка по

Лоури, D табл. 2 — соотношение удельных активностей ингибиторов трипсина и химотрипсина в зерне исходных и мутантных форм кукурузы, в табл. 3— характеристика анализа соотношения удельных активностей - удельной активности ингибитора трипсина к удельной активности ин ги битор а химотри псина для случая, когда показ атели з атрудняют идентификацию, в табл. 4 - выявление наличия гена Опейк-2 в одном сортообразце при отсутствии исходных анапо гов.

На чертеже изображен калибровочный график определения белка по Лоури с предварительным осаждением бычьего сывороточного альбумина.

1642966

Способ осуществляют следукщим образом, Для выполнения работы предварительно подготавливают реактивы H строят ка либровочные кривые. !. Раствор химотрипсина с концентрацией 15 мкг/мл (3 мг фермента растворяют в 10 мп бидистиллированной воды), затем перед определением раст- 0 вор .разбавляют в 16 раз и спектрофотометрически определяют концентрацию фермента по формуле

С=ЕМД28 (м /. )

280 15 где Е - коэффициент молярной экстинкцип, равный для хи мотри псин а

О 50;

Д - поглощение раствора фермента Z80 при 280 нм. 20

2. Раствор трипсина с концентрацией 25-30 мкг/мп (7,5 мг перекристаллиэованного трипсина растворяют в смеси 10 мп 0,001 н НС1 к 15 мп бидиатиллированной воды рН 4,5 ) . 15

Для приготовления исходного раствора при определении ингибиторной активности и построении калибровочной кривой раствор фермента разбавляют в 7 раз бидистиллированной водой непос- 10 редственно при определении, Концентрацию фермента определяют по формуле

С=ЕРЕД ЯЯО где Е - коэффициент моляр ной э катинкции, р авный для три псина

0,65;

Д вЂ” поглощение раствора фермента

200 при 280 нм, 3. 17-ный раствор казеина (2,5 r 40 казеина по Гаммератену суапендируют в 250 мп, 0,1 М Фосфатного буфера рН

7,7) оставляют на 2 ч в холодильнике набухать. Затем нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при по- 45 мешивании. После охлаждения раствор фильтруют, 4. 0,1 M фосфатный буфер рН 7,7 (на 259 мл буФера 2,6 7 г !1а2НР04 2Н 0 и 0,2227 г КН2Р04).

5С

5, 5Х-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

К равным навескам муки 0,5-1 г. образцов зерна кукурузы прибавляют воду в соотношении 1:20 и выдерживают при

0-20 С при помешивании 2 ч, центрифугируют 10-15 мин при 2000-3000 об/мин и супернатант отделяют от осадка, В пробирках смешивают 0,2 мл водного экстракта зерна кукурузы 1:20 с

0,3 мл буфера 3, для определения ак» тивности ингибитора химотрипсина берут 0,4 мл экстракта и 0,1 мл буфера, прибавляют 0,5 мп раствора фермента и выдерживают при комнатной температуре 10 мин, затем прибавляют 1 мп раствора казеина, инкубируют при 350С на водяной бане 20 мин и останавливают реакцию, прибавляя 3 мл 57-ной трихлоруксусной кислоты.

Для каждой пробы готовят соответствующую нулевую пробу: прибавляют реагенты аналогично описанному, вводя раствор трпхлоруксусной кислоты перед раствором казеина.

Контроль фермента: к 0,5 мп буфера прибавляют 0,5 мп раствора фермента, затем 1 мп раствора казеина и после инкубации при 35О С в течение

20 мин - 3 мл 57-ной ТХУ. Пробы оставляют при комнатной температуре на

30 мин для более полного формирования осадка, затем осадок отфильтровывают через сетчатый фильтр и измеряют поглощение раствора против соответ ствующей нулевой пробы при 280 нм. Кон троль фермента измеряют против его нулевой пробы.

Содержание ингибитора рассчитывают пр Фор мул е

С E 7 < m

Е ре М где И вЂ” ингибиторная активность, мг фермента/! г муки;

С вЂ” концентрация исходного раствор а фер мент а, мг/мп;

E — разность между экстинкциями акт контроля фермента и опытной пробой, измеренная против соответствующих нулевых проб;

E < о - экстинкция контроля фермента;

n — разведение исходного экстрак" та ингибитора по отношению к обьему фермента (п=У мл фермента/У мл экстракта); m — первоначальное разведение ис» ходного экстракта (в данном случае оно равно 21).

Удельную активность ингибиторов рассчитывают по формуле

И мг ферм. /г муки

УИ=

С r белка/г муки где УИ - удельная .активность, мг фермента/1 г белка;

1642966

С - содержание белка по Лоури, г/г муки.

Метод определения содержания белка по. Лоури основан на образовании окра5 шенных ароматических аминокислот с реактивомм Фолина в сочет анни с биур етовой реакцией на пептидные связи. Высокая чувствительность метода дает возможность определять 10-100 мкг бел- 0 ка в пробе.

Существует много модификаций метода Лоури, позволяющих устранить влияние некоторых небелковых компонентов среды на развитие окраски. В случае определения содержания белка в зерне кукурузы целесообразно предварительное осаждение белка из растворов, например, трихлоруксусной кислотой с последующим растворением их в щелочных растворах.

P еакти вы:

1. Иа СО> — 2X.-ный раствор в

О, 1 н растворе МаОН.

2. Си$04 5Н 0 — 0,5X-ный раствор в

17 цитрата натрия, 3. P абочий р аст вор — 1 мп р еактива 2 в де нь определения смеши вают с

50 мл реактива 1.

4, Реактив Фолина-Чокапьтеу: 10 г

Na+Wa04 2H >O (пере крист аллиэ ованный ) и 2, 5 г 11а, 1оО 2112 0 помещают в круглодонную колбу на 200-250 мл, приливают 70 мп воды и хорошо перемешивают, К полученному раствору добавляют 35

5 мп 857-ного раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной НС1.

Колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят в течение 10 ч.

Затем раствор охлаждают, доводят во- 40 дой до 100 мл, фильтруют и разводят водой с таким расчетом, чтобы получился 1 н раствор кислоты (т, е. приблизительно в два раза). Дня этого кислотность определяют предваритель- 45 но, титруя р аэ веде нный в 10 р аз реактив 0,1 н щелочью в присутствии фенол фт ал еин а, Р е акти в може т хр ани т ься в темчой склянке длительное время, 5. CC1 COOH — 10X-ный раствор, 50

6. NaOH — 1 н раствор °

7. Стандартный раствор белка, бычьего сывороточного альбумина, содержащий 0,25 мг белка в 1 мт.

Для построения капибровочной кривой предварительно осаждают белок.

К 16,7 мп 10X CClgCOOH приливают

25 мп бычьего сывороточного апьбумина, тщательно перемешивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. Выпавший мелкодисперсный осадок белка отделяют центрифугиронанием втечение 30 мин при 13,5 тыс.o6. /

/мин и промывают 2Х-ным раствором

СС1 СООН. Раствор центрифугируют при тех же условиях. Супернатант сливают, а к осадку добавляют 2 мп l н раствора щелочи и осторожно перемешивают до полного растворения осадка.

Раствор белка количественно переносят в мерную колбу на 25 мя, доводят до метки водой, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

Путем разведения готовят рабочие растворы сывороточного альбумина концентрациями 10-100 мкг, помещают в пробирки, приливают в каждую 2 мп рабочего раствора 3, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на

10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолииа-Чокал ьтеу, содержимое пробирок тщательно перемешивают и через

30 мин колориметрируют при 750 нм.

Полученные результаты используют для построения калибровочного графика.

При определении содержания белка в зерне кукурузы используют водный раствор альбуминоной фракции и соблюдают те же условия, что и при построении кали бр о ночного гр афп ка. Объем раствора берут 0,4 мп, содержащий 10100 мг белка, предваритея ьпо осажденного трихлоруксусной кислотой. По калибровочному гр афику определяют содержание белка в опытной пробе.

Пример 1, Предложенным способом проводят анапиэ удельной активности ингибиторов тринсица и химотрипсина и определяют их соотношение в зрелом зерне исходных А 204 +++, Wf

9 +++, И 64 A +++ и мутантных A 204

64 линий кукурузы. у всех мутантных форм ку куру эы соо т ноше ни е удел ь ной активности трипсипа к удельной активности химотрипсина (УА. /УА,д ) составляет 6,6-34,7, а у исходных — 1,05,0. Данная з акономерность снидительствует, что у опсйковых форм кукурузы соотношение удельных активностей двух ингибиторов протеинаэ выше 5,0, а у исходных менее 4-5 сохраняется во все годы исследования.

Пример 2. Характеристика анализа соотношения удельных активностей ингибиторов протеиназ при граничных

164?966 Таблица l

Состав смесей реагентов при построении калибровочного графика определения белка по Поури

Раствор Содержани е белка, белка, МП МК Е

Р аст вор ФолиР або чин

Вод», р аст вор

3, м» на, мл мп

0,36

О, 32

0,28

0,24

0,20

0,16

0,08

0,40

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24

0,32

0,40

Контроль

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2

О

О

О

О

О

О

О

О

О ("стопорных") значениях коэффициента.

По 1 г муки кукуру,зы двух линий

155 исходной и мутантной урожая, 1984 г. исследуют предложенным способом. Для этого образцы заливают 20 мч

5 бидистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в течение 2 ч при комнатной темпар атур е, В су пернатанте определяют удельную активность ингибиторов трипсина, химотрипсина и их соотношение, По результатам анализов обнаружено (табл. 3, 1984 г, ), что наличие у одного из образцов значения соотношения 5,0 не дает возможности четко идентифицировать образец и причнслить era или к

1 исходной, или к мутантной форме кукурузы. Поэтому анализ повторяют для тех же линий из репродукции последующих

1985 и 1986 гг. Средние значения соотношения за три года н»глядно свидетельсвуют о необходимости причислить спорный образец к исходной линии без напичия гена Опейк-2. У опей- 25 ковой формы кукурузы соотношение удельных активностей ингибиторов за три года составляет 15,3-27,8, а у исходной — лишь 2,3-5,0 °

Пример 3, Выявление гена 30

Опейк-2 в одном сортообразце при отсутствии исходных аналогов, По 0,5 г му ки ку куру зы тре х гибридных о бр азцов кукурузы m К 3 о о > S и 2; Cr2o<

Wx и Км 212 заливают по 10 мп бидистиллированной воды и проводят экстракцию апьбуминов в течение 2 ч при комн атной темпе р атуре, В супернат анте определяют соотношение удельных акти вно ст ей и н гиби торов три псина и химотрипсина.

Данный пример свидетельствует о том, что высокие значения соотношений удельных активностей ингибиторов получены для зерна гибридов, содержащих в своем генотипе ген Опейк-2, а ниэ кое содержание соотношения 4,3 характерно для гибрида, не содержащего этот ген и позволяет выявлять ген Опейк-2 при анализе одного сортообразца или при отсутствии исходных аналогов.

Фор мул а из обретения

Способ селекционной диагностики зерна кукурузы на наличие гена

Опейк-2, включающий спектральный анализ активности ингибитора химотрипсина в альбуминовой фракции экстракта белков и последующее выявление опаковыхлиний, о тл и ч ающи и с я тем, что, с целью повышения точности и достоверности диагностики, упрощения и удешевления анализов, диагностику ведут по одному сортообразцу, при этом определяют удельную активность ингибитора трипсина и наличие гена

Опейк-2 устанавливают по соотношению удельной активности ингибитора трипсина к удепьной активности ингибитора химотрипсина и при их соотношении до 4-5 идентифицируют исходную форму, а при соотношении более 5опаковую линию.

1642966

Т аблиц а

Результаты исследования исходных и мутантных линий

Генотип кукурузы нг. хи

984 г.

1,0

Т аблиц а 3

Исследования генотипа с соотношением, близким к 5

Генотип кукурузы

23,4 27,8 15,3 22,2

W 155 +++ (4 155 о2о2о2

Т абли ца 4

Выявление гена Опейк -2 в одном сортообразце при отсутствии исходных аналогов

Тип кукурузы УА инг,трипс/

/УА инг. химотрипс.

87,3

13,8

4,3

mK 3 с оуэ S и 2

Cr2o 2W

Км 212

А 204 +++

А 204 с о о

Wf 9 +++

Wf 9 о,о,о

W 64 А +++

W 64 о о2 о 2

2,0

7,7

2,3

30 0

3,4

34,7

1,4

12,0

1,7

16,0

17 4 4 34 25

6,6 9,3 7,0 6,9

1,6 5,0 4,5 3,0

8,6 14,6 19,5 17,0

Зэб 4 в 3 3вО 3 ° 2

17,6 18,9 13,7 20,2 пс/УА инг. химотр. Среднее за 3 года

1985 г. 1986 г.

1642966

Оа4

0, 0,2

Оа

Х0 20 30 40 50 60 70 80 93

Со ст ави т ел ь В. Де мхи н

Техред Л.0лийнык

Корректор Л.Бескид

Редактор Н.Швыдкая..Ф

Тираж 372

Подписное

Заказ 1190

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауыская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат ".Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина, 101