Способ определения концентрации биополимеров в реакции связывания комплемента

Способ определения концентрации биополимеров в реакции связывания комплемента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

х (у) G 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ASTQPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4361953/13 (22) 08,01. 88 (46) 23.04.91. Бюл. У 15 (71) Чечено-Ингушский государственный университет им. Л.Н.Толстого (72) Г.А.Золенко (53) 543.9(088.8) (56) Лабораторное дело, 1986, В 9, с..548, Иммунологические методы./Под ред.

Г.Фримеля, 1987, М.: Медицина, с. 193. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

БИОПОЛИМЕРОВ В РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ

K0MIIJIEME8TA (57) Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано для определения полипептидов и нуклеиновых кислот в исследовательских лабораториях и лабораториях пищевой промьппленности. Целью изобретения является упрощение способа и расширение спектра. исследуемых веществ. Основу способа составляют две связанные реакции, Первая представляет собой конкурентную ферментативную систему: анализируемое вещество (полипептид, нуклеиновая кислота) тест-антиген-фермент (пептидаза или

Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано для определения полипептидов и нуклеиновых кислот в исследовательских лабораториях и лабораториях микробиологической промьшшенности.

„„SU„„1644037 А 1

2 нуклеаза) . Другая представляет постановку реакции связывания комплемента с участием тест-антигена, антисыворотки к нему и гемолитической системы. Способ допускает также анализ нуклеиновых кислот с нуклеазами, В этом случае очистка нуклеиновых кислот не является необходимой.

Специфичность анализа здесь обеспечена ферментом и инактивированным вирусом, при этом активность антигенов возрастает при обработке нуклеазой. Способ содержит три блока операций: 1, Хронометрическая инкубация анализируемого вещества и антигена в растворе фермента с последующей его инактивацией. 2. Постановка реакции связывания комплемента в инкубате. 3. Учет глубинй гемолиза и определение количества ана- С лизируемого вещества по калибровочной зависимости. Количество анализируемого вещества пропорционально количеству гемолизированных эритроцитов. Способ не требует получения специфической антисыворотки к исследуемому веществу и допускает возможность анализа большого числа поли- аиР пептидов, выделенных, например, с а помощью электрофореза. 2 табл. «3

Цель изобретения — упрощение способа и расширение спектра исследуемых веществ.

Пример 1. Для проведения анализа все необходимые растворы готовят с помощью взвешивания с точностью

1644037 до 0,1 мг на физиологическом растворе, имеющем рН 7, 18 при 20©С.

ПРоводят определение количества заданных по весу высокоочищенных белков разной молекулярной массы и структуры. В определениях используют следующие кристаллические реакти вы (наименование - молекулярная масса с 10 ): ф-глобулин лошади 150;

Ъ ,лактатдегидрогеназа бычья 136; гистон Н 15, 1; инсулин бычий 6,0.

В кинетическую систему, кроме инсулина„ входят трипсин в концентрации 25. нг H антиген, представленный инактивированным аденовирусом 6 в .культуре AI имеющий концентрацию

40 нг.

Реагенты метрологической системы — специфическая сыворотка, комплемент, гемолизин, эритроциты барана — готовят в титрах, рекомендованных в прилагаемым к ним инструкциям по реакции связывания компле.мента (PCK) - диагностике аденовирус- д5 ных антител в сыворотке крови.

Кинетическую систему готовят в центрифужных пробирках путем смешения по 0,333 г каждой из ее рабочих концентраций и инкубирована в течение

30+0 05 мин в водяной бане при

,3710,2 С. Время дезактивации фермента 2 - 2,2 мин при 60-65 С. Все опеРации с растворами кинетической .:. системы проводят в условиях изоляции

35 и обеспыленной атмосфере, Остальные операции, постановка

PCK и учет глубины гемолиза проводят согласно инструкциям по РСК-диагностике с испОльзОванием прямОгО сче 40 та эритроцитов в камере Горяева.

Среднее их количество (О) в четырех больших квадратах принимают в качестве учетной величины для калибровочной зависимости

В табл. 1 приведены результаты анализа.

Пример 2, Для анализа ДНК предварительно проводят сенсибилизацию 1 мг антигена к ДНКазе.

Сенсибилизация вируса основана на известном свойстве ДНК образовывать

"сплавы" с некоторыми из биополимеров. "Сплавление" произведено в следующем режиме.

Смешивают кристаллический антиген 55 с кристаллической ДНК и бидистиллированной .водой в соотношении масс

10:5:3-5. Экспонируют материал при

85-904С в течение 1 ч. Охлаждают материал в течение 2-2,5 ч до комнатной температуры. Готовят рабочий ра створ антигена с необходимым значением рН из полученного материала.

Созревание раствора в течение суток при 4-54С.

При хранении на.холоду рабочий раствор пригоден для использования в течение.10-15 сут. Перед постановкой анализа необходим контроль активности антигена.

Из сенсибилизированного антигена готовят рабочий его раствор, обеспечивающий неполный гемолиз эритроцитов в PCK (100-300 ед. в учетном объеме). Кинетическую . систему в этом случае составляют из рабочей концентрации сенсибилизированного антигена, раствора ДНКазы и растворов ДНК в концентрациях 0;.50; 250;

1250 нг. В остальном порядок и режимы определения калибровочных зависимостей не отличаются От описанных в примере 1. Результаты калибровки приведены в табл. 1, Пример 3. Результаты всех контрольных определений приведены в табл. 2 в порядке задано/определено.

Контрольный анализ ДНК проводят в сыворотке крови крысы, из которой удалены мешающие определению следы

ДНК и подавлена собственная ДНКазная активность следующими приемами: вводят в сыворотку ДНКазы (11,5 мкг/мл), инкубируют материал (2 ч, 37,7 C), вводят трипсин (11,5 мкг/мл), инкубируют материал (3 ч, 37,74С), инактивируют фермент (20 мин, 65-704С), При анализе ДНК в нативном материале первые две операции излишни.

Формупа изобретения

Способ определения концентрации биополимеров в реакции связывания комплемента, включающий контактирование исследуемого вещества со специфическими антителами, комплементом и гемосистемой с последующим учетом результатов по глубине гемолиза эритроцитов, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью укрощения способа и расширения спектра исследуемых веществ, исследуемое вещество предварительно инкубируют

1644037 с тест-антигеном — аденовирусом 6 в концентрации, обеспечивающей в постановочном опыте гемолиэ 10 -10 эритроцитов, и ферментом, специфичным к исследуемому веществу и тестантигену, в концентрации, обеспечиТаблица 1

Концентра- Число негемолизованных ЭБ при ция Aep- . концентрации, нг

Соединение мен1а

0 10 100 1000

-96,5

-12,5

-0

-2,5

68,5

25,5

85,5

83,0

51,0

90,0

-2,5

-2,5

-250,0

-12,5

-12,5

-0,5

18 0

17,0

50 0

63,5

30 5

70,5

-250,0

88,5

48,0

65,0

-0

-4,0

-144,5

-205,0

185,5

146,0

161,0

Таблица 2

Задано/определено, нг, по примерам

Вещество

1 2 3

f -ÃëoáóëèH

Лактатдегидрогенаэа

Гистон

Инсулин

Инсулин + гистон, 1:10

ДНК

10/12 20/18 40/37

15/13 60/55 240/260

25/30 100/95 400/440

10/15 100/85 1000/870

10/13 100/92 1000/930

60/90 180/205 500/540

Составитель Д.Папковский

Редактор С.Патрушева Техред Л.Олийнык Корректор M. Самборская

Заказ 1237 Тираж 415 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101. Антиген g-Глобулин

Лактатдегидрогеназа

ГистонИнсулин

Инсулин + ф-глобулин, 1: 1

Калибровка:

Антиген

ДНК вающей протекание конкурентной ферментативной реакции, далее фермент инактивируют, а полученную ре5 акционную смесь контактируют со спе-. цифическими антителами к тест-антигену.