Способ получения панкреатина из поджелудочной железы

Способ получения панкреатина из поджелудочной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , в частности к способу получения лекарственных средств. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта с более высокой активностью. Для этого замороженные свиные поджелудочные железы размельчают, пропуская через мясорубку, и проводят ауто/ -W 2 лиз при температуре (-2)-(+30)°С и рН 6,5-8,5. Параллельно через каждые 15 мин анализируют пробу на осаждение в 55-65%-ном водном изопропилозом спирте. При наличии скорости осаждения ауюлиза 3-10 ммв течение 1-3 мин прекращают аутолиз путем добавления изопропилового спирта до конечной концентрации 30-35%, затем проводят фильтрование через сито, В полученный раствор добавляют изопропиловый спирт в конечной концентрации 55-65% при 20-24°Со Полученный осадок промывают нзопропиловым спир том концентрацией 75-95%. Суспензию фильтруют на нуч-фильтре диаметром 40 см и отсасывают для просушивания в вакууме при 55°С и давлении 5 мбар„ Способ позволяет повысить выход целевого продукта с более высокой активностью . 4 табл. S

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (Д1) А 61 К 35/39

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3682185/14 (22) 29. 12.83 (31) Р 3248587.5; P 3248588.3 (32) 30.12.82 (33) DE (46) 23.04.91. Бвп. Р 15 (7 1) Нордмарк-Верке ГмбХ (дЕ) (72) Ханс Иультце (DE) (53) 615.45(088.8) (56) Патент С1)А Р 3223594, кл. 195-68, 1965. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИНА ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОИ ЖЕЛЕЗЫ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения лекарственных средств. Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта с более высокой активностью.

Для этого замороженные свиные поджелудочные железы размельчают, пропуская через мясорубку, и проводят аутоизобретение относится к медицине, в частности к способам получения лекарственных средств.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта с более высокой активностью.

Пример 1. 100 кг замороженных при низкой температуре свиных поджелудочных желез, пропупенных через волк-машину или через мясорубку, перемешивают в 250-литровом реак.торе с раствором 100 r глюконата кальция в 20 л воды совместно с 200 г силиконового препарата, препятствующего пенообразованию. В зависимости от содержания свободного трипсина

ÄÄSUÄÄ 1644712

2 лиэ при температуре (-2)-(+30)оС и рН 6>5-8,5. Параллельно через каждые 15 мин анализируют пробу на осаждение в 55-65Е-ном водном изопропиловом спирте. При наличии скорости осаждения аутолпза 3-10 ммв течение

1-3 мин прекращают аутолиз путем добавления иэопропилового спирта до конечной концентрации 30-352, затем проводят фильтрование через сито, В полученный раствор добавляют изопропиловый спирт в конечной концентрации 55-657. при 20-24 С. Полученный осадок промывают изопропиловым спиртом концентрацией 75-95Х. Суспензию фильтруют на нуч-фильтре диаметром

40 см и отсасывают для просушивания в вакууме при 55 С и давлении 5 мбар.

Способ позволяет повысить выход це.левого продукта с более высокой ак" тивностью. 4 табл. в железах добавляют в качестве сред- @ ства, способствующего началу процес- Ф са, до 1 кг готового панкреатина, 3 растворенного в 5 л воды. Зто количе- @ ство панкреатина устанавливают по- ФЯ средством "37 пробы на гидролиз".

С этой целью отбирают из загруженной партии 120 г исходного материала.

После добавления 15 л 847.-ного изопропилового спирта замешивают ра- В® створ 1,3 кг бикарбоната натрия (A в 20 л воды. Оставляют стоять на ночь, причем температура возрастает пример,но от 2 до 12 С, на следующее утро подогревают до 20 С и продолжают перео мешивание при этой температуре.

1644712

Момент окончания аутолиэа распознают пробой на осаждение. С этой целью во время последнего периода аутолиза сначала каждые полчаса, затем через каждые 15 мин отбирают 10 г суспензия, перемешивают 1 мин с 5,4 мл 84Х-ного изопропилового спирта с помощью стеклянной палочки, образовавшийся раствор отделяют от волокон, приставших к стеклянной палочке и замешивают в

20 мл содержащегося в стакане на

50 мл, снабженном магнитной мешалкой, 84Х-ного водного раствора изопропило вого спирта. Через минуту останавли вают мешалку и оставляют для осажде ния примерно 3 мин.

Если проба положительна, аутолиз (наличие более или менее прозрачного слоя высотой 3 мм через 1 мин или 20

10 мм через 3 мин) заканчивают.

В качестве примера воспроизводится. характерная серия испытаний на осажде" ние, которые применяли, как только температура автолизата достигала 25

200С.

Данные испытания на осаждение приведены в табл. 1.

Из этого примера видно, что наиболее благоприятный момент времени 3> для окончания аутолиза наступает через 3 ч. Для того, чтобы получить возможность достижения сравнимых соотношений при применении неизвестных (иапример, сохранявшихся более корот- 3 кое или более продолжительное время) препаратов свиных поджелудочных желез, проводится "37 проба на гидролиз". Из кащицеобразной массы желез, смешанных с глюконатом кальция, 10 отбирают 120 г, смешивают с 1,5 r бикарбоната натрия в 25 мл воды и перемешивают 30 мин при 37 С. С пробой этого ускоренного аутолизата проводят испытание на осаждение. К основной массе загруженного материала добавляют свободный трипсин (в форме панкреатина) в следующих количествах: менее чем при 2 мм/3 мин — 2 млн. Е, при значении до 12 мм/1 мин — 1 мчн. Е а при еще большей скорости осаждения свободный трипсин не добавляют (1 млн. единиц свободного трипсина содержи ся, например, в 250 r поджелудочной железы с 4000 единицами в i r). Таким э5 путем возможно стандартизировать для практических производственных условий сырьевой исходный материал различного происхождения .

93,6

После определения наиболее благоприятного момента времени аутолиз загруженной партии заканчивают посредством подачи насосом 72,5 л 84Х-ного (регенерированного) изопропилового спирта. Перемешивают 1/2 ч, причем образуется прозрачный раствор, содержащий нерастворимые волокна, которые отделяют отсеиванием. Для этого содержимое реактора спускают в открытьгй котел на 50 л с заложенным ситом, имеющим ячейки около 5 мм. 1(отел снабжен якорной мешалкой. Сточный патрубок котла, снабженного ситом, соединяют посредством насоса с 500-литро" вой емкостью из полипропилена. В эту емкость загружают 318 л 84Х-ного изопропилового спирта, туда же теперь добавляют примедленном перемешивании спускаемый раствор, пропущенный через сито. Волокна, оставшиеся в котле иа сите, перемешивают еще 10 мин, причем волокна становятся относительно сухими. Вес волокон составляет 78 кг.

В 500-литровый резервуар помещают панкреатин в виде грубого осадка в течение 1 ч на объем 80 л (при 20 С; при 24 С в течение 1/2 ч. Отстоявшуюся жидкость спускают сифоном и направляют для регенерации на перегонку.

Массу, оставшуюся на днище, перемешивают с 63 л регенерированного 84Х-ного изопропилового спирта и оставляют еще на ночь для дополнительного осаждения. На следующий день этот процесс повторяют, смешивают полученный таким путем осадок на днище примерно с 45 л

84%-ного изопропилового спирта, т.е. с настолько большим количеством, чем необходимо для приготовления суспензии панкреатина в 84Х-ном изопропиловом спирте. Эту суспензию фильтруют на нуч"фильтре диаметром 40 см и отсасывают до хорошего просушивания.

Плотную массу, отжатую на фильтре, быстро измельчают на резательной машине и распределяют на металлическом листе. Высушивают всю ночь при температуре обогрева до 55 С при вакууме

О приблизительно 5 мбар.

Выход панкреатина, кг 11,6

Активность амилазы, FiP F/ìã

Активность липазы, FiP =Е/мг 90,3

Активность протеазы, FiP=E/ìã:

1644712

4,2

4,1

28,3

28,3

98,7

0,4

0,65

0,76

20 активированной энтерокинаэой 5,6 без активирования 5 6

Активность трипсина, F .Р=Е/мг:

i активированного энтерокиназой без активирования

Активность химотрипсина, 10

FiP=E/мг: . активированного энтерокиназой беэ активирования

Содержание сухого вещества, Х

Содержание жира, Х

Плотность насыпная, г/мл

Плотность, г/мл

Число микроорганизмов, на 1 r 200

Нежелательные микроорганизмы по

Фармакописи СНА 17-ro издания (USP

ХУП) отсутствуют.

Пример ы 2 - 4. Поступают 25 аналогично примеру 1, изменяя условия проведения способа (рН, содержание изопропанала, температуру при аутолизе или содержание изопропанола при прерывании или температуру и содержа- 30 ние изонропанола при осаждении/промывании). Разницы в выходе по панкреатину не наблюдается, если испытание на осаждение варьировать в каждом случае в пределахдиапазона от 3 до 10 мм/мин. Эти условия были испытаны для каждого примера в отдельности.

Результаты испытаний приведены в

:табл. 2.

Пример 5. Поступают аналогично примеру 1, но без добавки изопропанола. Конца аутолкза достигают через 2,5 ч ° Активность амилазы 83Х при нагрузочной потере 5Х и активность липазы 80Х при нагрузочкой потере 15Х.

Пример 6. Поступают аналогично примеру 1, добавляя 5 л пропанола, Конца аутолиза при этом достигают через 2,75 ч. Активность амилаэы 88Х при нагрузочной потере около 5Х; а липаэы 88Х при нагрузочкой потере 1ОХ.

Пример 7. Поступают аналогично примеру 1, но добавляют 10 л изопропанола. Конца аутолиэа достигают через 3 ч. Активность амилазы 93Х (нагрузочная потеря 5Х) и липазы 88Х (нагрузочная потеря ЯХ).

П р н м е р 8. Если поступить аналогично примеру 1 и повысить температуру до 25 С, а потом прервать реако цию, то достигнутые результаты будут те же, что и при температуре 15 С.

Пример и 9. — 12. Аутолиз и осаждение смеси энэимов иэ водного аутолиэата осуществляют, как описано в примере 1. Чтобы определить влияние концентрации изопропилового спирта на процесс промывания, к пробам суспензии панкреатина добавляют изопропиловый спирт разной концентрации. Применяют по 1 л осадка, полученного в результате сливания сиФоном отстоявшегося верхнего слоя жидкости., 1 л осадка соответствует количеству приблизительно 200 r сухого панкреатина.

К каждой пробе добавляют по 1 л изопропилового спирта. Разные концент" рации получают в результате разбавления абсолютного иэопронилового спирта. Плотный Аильтровальный осадок, полученный, как описано в примере 1 в результате двухкратного промывания и отсасывания на нутче, подвергают высушиванию, как описано в примере после чего определяют его активность и насыпной вес. При применении только

65Х-ного изопропилового спирта наблюдается небольшое уменьшение активности. Несмотря на это качество полученного в результате продукта выше, чем качество известных продуктов. Насып" ной вес продукта уменьшается с увеличением концентрации изопропилового спирта. Результаты приведены в табл. 3.

Данные сравнения стабильности ами" лазы и липазы у панкреатина приготовленного по известному и предлагаемому способам, представлены в табл. 4.

Табл. 4 показывает, что у панкреатина, полученного известными .способами, потеря при нагрузке сильно возрастает по мере увеличения активности.

Что касается панкреатина, изготовленного-по предложенному способу, то несмотря на существенно высокую знзим . ную активность, он отличается при нагрузке наименьшей потерей.

Формула и s обр ет ения

Способ получения панкреатина из поджелудочной железы путем проведения аутолиза при комнатной температуре, 1644712, перемешивания с органическим раство рителемм, удаления осадка фильтрацней, промывания его органическим растворителем и высушивания, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышеизопропиловым спиртом, а высушнвание проводят в среде азота при давлении

5 мбар.

Таблица 1 ния выхода целевого продукта.с более высокой активностью, аутолиз проводят в реакторе при рН 6,5-8,5 и температуре {-2)-{+30) С, при этом одновременно анализируют пробу, взятую из .реактора, на осаждение в,55-65Х-ном водном изопропиловом спирте и, как только в пробе достигается скорость

Продолжительность . аутолиsa при 20 С, Значение аутолиза мм/0,5 мин мм/

/3 мин мм/1 мин

1,00 осалдения выпавшего в осадок аутоли- 15 2 00 эата 3-10 мм в течение 1-3 мин, пре- 2,50 кращают аутолиз в реакторе путем до- 2,75 баапения изопропилового спирта до ко- 3,00 нечной концентрации 30-35Х, затем по- 3 ° 25 сле фильтрации в полученный раствор gp 3,50 вновь добавляют изопропиловый спирт 3,75 до концентрации 55-65Х при 20-24 С, 4,00 полученный осадок промывают 75-95Х-ным

Та бли ца 2

Пример

Промывание +

+ сушка, Х c587oH

Аутолиз рН

Выход (амилаэа) пыта Осажд ение е, /мин

Х C H>oH

30 65 88

30 65 85

10 55 91

10 55 89

15 60 94

15 60 91

Пример 9 10 11 12

Промывная жидкость (Х иэопропило, вого спирта) 65

Активность, РУРЕ/г3

Аьялаза

Липаза

Протеаэа

93,6

90,4

93,5

90,5

84,3

72,3

93,6

90,3

Иасыпной вес, г/100 мп 5,3

5,6

5,6

6,5

6,5

7 0

7ФО

8,5

8,5

0

30 3 .. 30 10

-2 3

-2 10

15 3

15 10

32

32

0

0

1

5

14

0

1

6

18

0

4

18

1644712

Та блица 4

Способ

Амила за

Липаза

Исходнаяя акИсход- Потеря ная ак- при нативность, грузке, Х

FiP-.Å/ìã тивность, FiP-Е/мг

Известный

Пр едлагаеMblH

93,6

90,3

Составитель Л.Конюхова

Техред М.Дндык Корректор 0.1Ь пле

Редактор 0.19рковецкая

Заказ 1249 Тираж 460 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,103

43,1

57,2

51 0

41

40,7

37,0

40,3

Потеря при на" грузке, Х

31