Способ определения ротавирусных антигенов

Способ определения ротавирусных антигенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к вирусологии и мохет найти применение при диагностике острых вирусных инфекций, Целью изобретения является упрощение метода, повыпение чувствительности„ Для этого исследуемый материал наносят на мембранный фильтр с размером пор 0,2-0,6 мкм, инкубируют в буферном растворе с бычьим сывороточньм альбумином и на этом растворе выполняют разведения реагентов, этапы исследования осуцествляют путем погружения фильтров в соответствующие растворы , в качестве ферментной метки применяют антипероксидазные антитела в комплексе с пероксидазон, учет реакции производится визуально через 4-5 ч о Преимуществом предлагаемого способа является упрощение, повышение результативности в 1,1-1,5 раза, сокращение сроков исследования в 4,4-6 раз, снижение затрат на реагенты в 28 раз. 3 табл. g tiafr 1В 2 СЛ ьэ СЈ х

СООЭ СОЯЕТСНИХ

КСПМ ЛИН

„„SU„„1645298 A 1 (g1)g . С 12 N 7/00, С 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А 6ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕШ1Я РОТАВИРУСНЬИ

АНТИГЕ НОВ (57) Изобретение относится к вирусологии и может найти применение при диагностике острых вирусных инфекций, Целью изобретения является упроцение метода, повыиение чувствительности.

Для этого исследуемый материал наносят на мембранный Фильтр с размеромпор 0,2-0,6 мкм, инкубируют в буферном растворе с бычьим сывороточным альбумином и на этом растворе выполняют разведения реагентов, этапы исследования осуцествляют путем погружения фильтров в соответствуюцие растворы, в качестве Ферментной метки применяют антипероксидаэные антитела в комплексе с пероксидаэой, учет реакции производится визуально через 4-5 ч. Иреииуцеством предлагаемого способа является упрощение, повыление результативности в 1,1-1,5 раза, сокрацение сроков исследования в 4,4-6 раз, снижение затрат на реагенты в

28 раз. 3 табл.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

% И fHHT СССР (21) 4678282/13 (22) 07.03.89 (46) 30.04.91. Был. h- 16 (71) Харьковский научно-исследовательский институт микробиологии, вакцин и сывороток им. И.И. мечникова, 1 иевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных заболеваниц им. JI.Â. Громаыевского и Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

А1Ш СССР (72) А.И. Посатенко, JI.Г, Грунтовская, Р.И. Киселев, JI.À. Панченко, И„В. Коробкова, Т.В. Палант, С.JI. Рыбалко, Н.В. Иванская, Л.А. Шекоян, В„А. Казанцева и В.А. Гиневская (53) 576.8.094.29(088.8) (56) Горбачев Е.Н. и др. Иммуноферментиый анализ в диагностике рбтавирусных гастроэнтеритов людей. Вопросы вирусологии, 1.986, Р 6, с. 743-746, Schumacher Bernd fur diagnostik

von }, огачдгцз infektivnen: Vergleich

von direkterii und inderektera I:LISA zum

Antigennachneis, 1986, h 21, 17371740.

К. Klin. Песа. 1986, Р 21, 17371740.

Изобретение относится к вирусологии и может найти применение при диагностике острых вирусных инфекций.

Цель изобретения — упроцение мето-, да, повьыение чувствительности.

Исследуемый материал наносят на мембранные <фильтры отечественного производства, характеризуюциеся равномерным распределением гидрофобных участков, обеспечивающие прочную фиксацию антигена за короткое время путем

Физической адсорбцни и исключающие колебания в количестве связываюцего- " ся белка на разных участках носителя и потерю их на последующих этапах анализа. Проводят инкубацию с

1645298 бычьим сывороточным альбумином и выполняют разведения всех реагентов на калий-калиевом фосфатном буферном растворе с бычьим сывороточным альбумином, промывают фильтры на всех этапах анализа этим же буферным раствором с включением детергента— твин 20, что позволяет уменьшить неспецифическое связывание. Используют антипероксидазные антитела в комплексе с пероксидазой на стадии сформировавыегося комплекса "антиген-антитело-антивидовое антитело", приводящего к связыванию фермента через антитела к ферменту, что повыыает чувствительность способа. Осуществляют анализ по принципу погружения носителя в растворы.

Основанием для выбора твердого носителя, состава буферного раствора для разведения реагентов и отмывки носителя, условий проведения этапов анализа, длительности стадий инкубации служат экспериментальные исследования, результаты которых представлены в табл. 1.

Еак видно из представленных в таблице данных, мембранные фильтры Деснянского производства не уступают по сорбционной способности фильтрам зарубежного производства.

Введение ферментной метки типа антипероксидазных антител в комплексе с пероксидазой позволяет увеличить число положительных находок в исследуемом материале в 1,5 раза„

Ротавирусный антиген обнаруживают с одинаковой частотой при инкубации в течение 18 ч при 4 С и в условиях териостата — в течение 1-2 ч.

Анализ приведенных данных свидетельствует также о целесообразности использования при осуществлении анализа 0,15-0,221 калий-калиевого фосфатного буфера рН 7,5, так как применение этого буфера позволяет обнаружить наибольшее число положительных проб.

Суыественное значение оказывает и введение стадии инкубации твердого носителя в буферном растворе с 1,5 2,0Х бычьего сывороточного альбумина, повышая процент обнаружения ротавирусных антигенов в сравнении с данньии, когда эта стадия не вводится.

В качестве исследуемого материала берут фекалии больных острыми кишечныии инфекцияии в виде фильтратов 10Х

5

55 суспенэии исходной пробы или нефильтрованных суспензий, собранных не позднее пятого дня от начала заболевания и приготовленных по общепринятой методике.

Способ осуществляется следующим образом и состоит иэ двух этапов: подготовительного и основного.

Подготовительный этап включает: определение размера фильтра для проведения исследования, разметку и шифровку; размножение вирусов на культуре клеток с целью получения антигенов (положительный и отрицательный контроль); приготовление калий-калиевого фосфатного буферного раствора и трисНС1; приготовление необходимых разведений реагентов, используемых в анализе.

В работу берутся мембранный фильтр

М 1 — h 2 с размерами пор 0,2-0,6@m

Деснянского производства диаметром

9,5 си при исследовании большого числа образцов одновременно (более 400) или часть его, либо число проб невелико. На глянцевой стороне фильтра простым карандашом обозначают номер и ставят метку в виде точки (или черточки), указывающей порядок нанесения исследуемых проб.

На матовой поверхности фильтра шляпкой гвоздя 50 мм отмечают кружочки-метки на расстоянии 1 мм одна от другой, располагая метки по прямой линии. В каждый,иэ них тонко оттянутой пастеровской пипеткой или пипеткой" дозатором в виде нерастекаюцейся капли вносят 1-2 мкл исследуемого материала. Номер образца записывают в рабочеи журнале в такой последовательности, как вйосят на фильтр.

На каждый фильтр наносят положи-. тельный и отрицательный контроли.

Иесто нанесения определяет исследователь. В качестве контролей используют вируссодержащую культуральную жидкость, освобожденную от клеточного детрита центрифугированием при

2000 об/мин в течение 20 мии. Заражающая доза вируса, выбор культуры клеток, состав ростовой и поддерживающей среды, условия накопления вируса соответствуют обцепринятын для культивируемого вируса. Для получения ротавирусного антигена (положительный контроль) ротавирусом SA-II инфицируют перевиваемые линии клеток почек зеленой мартышки, а для получения полиовиг

5 164 русного антигепа (отрицательный контроль) вакцинным штаммом вируса полиомиелита типа П<4 заражают Нер-2, Положительный и отрицательный контроли в опыт берут в двух разведениях цельный и 1:10.

Калий-калиевый фосфатный буферный ,раствор готовят 0,15-Ц2И РН 7,5 с использованием 21! НОС1и на его основе готовят раствор с 1,5-2,07. бычьим сывороточным альбумином для приготовления разведений реагентов и с

0,057 твин-20 для промывки фильтра после каждого этапа анализа.

Разведения иммуной сыворотки, диагностических антител против глобухп Пов кролика, антител антипероксидазы в комплексе с пероксидазой выполняют согласно наставлениям, Для приготовления раствора субстрата готовят 0,5ll трис-НС1 РН 7,5.

Трис-НС1 доводят до кипения, вносят субстрат — диаминобензидин из расчета 0,4 мг/ л и после охлаждения добавлявт 5 мкл/ил ЗЕ-ной перекиси водорода.

Способ определения ротавирусных антигенов осуществляют следуюцим образом.

На мембранные фильтр л Ф1 - 9- 2 с размером пор О, 2- G, 6ðò Дес нянского производства наносят по 1-2 мкл исследуемого материала и два контроля (положительный и отрицательный). Выдержнвают при комнатной температуре до высушивания и погружают в буферный раствор с 1,5-2,07. бычьего сывороточного альбумина„ Инкубируют при

37 С в течение 1 ч, сливают буфер и замораживают его для повторного использования.

Фильтр погружают в раствор кроличьей иммуной сыворотки в отношении ротавируса SA-II в рабочем разведении. Инкубируют при 37ОС в течение

1 ч. Имунную сыворотку сливают и замораживают, а фильтр трижды отмывают в буферном растворе с 0,057. твин-20.

Затем фильтр погружают в раствор диагностических антител против глубилинов кролика в рабочем разведении.

Выдерживают при 37ОC в течение 1 ч, сыворотку сливают и замораживают, а фильтр трижды отмывают по 4 мин в буфере с 0,057 твин-20.

Фильтр погружаит в раствор антипероксидазных антител в комплексе с пероксидазой в Рабочем Разведении.

5298

Инкубируют при 37 С в течение 1 ч, сливают раствор комплекса и эамораживают., Фильтр трижды отмывают в буфернгм растворе с 0,052 твин-20 и погружают в свежеприготовленный раствор диаиинобензидина.

Через 3-5 мин после светло-коричневого окрапливания положительного контроля иммунохимическую реакцию останавливают, погружая фильтр в дистиллированную воду.

Учет проводят визуально после подсушивания на фильтровальной бумаге.

Лредлагаегым способом обследуют

164 больных острыми кишечными инфекциями в период спорадической заболеваемости и 66 больных из очагов.

Сравнительные данные определения

20 ротавирусных антигенов в инфекционном материале от больных предлагаемым и известным способом представлены в табл. 2.

Как видно из представленных данных, при исследовании инфекционного материала предлагаемым способом ротавируспнй антиген определяют в 1,5 раза чаце при обследовании спорадических .больных и в 1,1 раза в период группо30 вых заболеваний, сокрацая время анализа в 4,4-6 раз (разница показателей статистически достоверна).

Техника постановки анализа позволя35 ет повторно (до 5 раз) использовать дорогостояцие реагенты, что значительно снюыет зкономические затраты (табл. 3).

40 ормула изобретения

Способ определения ротавирусных антигенов, включаюций взаимодействие антител с иимобилизовапньм на носите45 ле антигеном с использованием ферментной метки и буферного раствора с лоследувцей оценкой результатов, о т— л и ч а в ц и и с я тем, что, с целью упроцения метода и повышения чувствительности, взаимодействие осуцествлявт путем погружения носителя в растворы реагентов, при этом в качестве носителя используют мембранный фильтр, в качестве ферментной метки используют антипероксидазные анти тела в комплексе с пероксидазой, в качестве буфера используют 0 15-0 ° 2И калий-калиевьпr фосфатный буфер с 1,52,01 бычьего сывороточного альбумина.

1645298

Таблица 1

1 L

Исследовано образцов серий полновнрусного антигена (отрицательньй контроль) абс.ч. в т.ч. с абс.ч. бс.ч. в т.ч. с в т.ч., с полови половительньи нмч результатом тель ньи ре зультатом результатом

47.0

47

47

47

47

47

47

47

47

О

0

8

8

8

8

17

17

17

17

47

47

47

47

12

47

Условия проведения анализа ип мембранного фильтра

: Сынпор 0,2 (цв

GSVP

04/00 0,2 ре

GS Т".РЕ

0,22 (IA rn

Деснянского производства 0,2-0,6 JMtn .

Вид буферного раствора

PBS О,!МрН 7,4

Натрий-натриевый фосфатньп буфер

0,1?1 рН 7,5

Трис-ИС1 0,01И рН 7,5

Калий-калиевый фосфатный буфер

0,15И рН 7,5

Калий-калиевый фосфатный буфер

0,2И рН 7,5

Калий-калиевый фосфатньй буфер

03? рН 7,5

Продолиительность инкубации с иммунной сывороткой

18 ч 49С

2 ч 37РС

1 ° 5ч37С

1,0 z 37 С

0,5 ч 37 С

Введение стадии иикубации с бычьим сывороточным аль бумином

1%-ный бычий сывороточный альбумин

1,5X .""фекционного мариала от бальных ! серий ротавирусного антигена (нолозительный контроль) половитель1645298

Продолжение табл.1

1 1 условия проведения анализа серий ротавирусного антигена (положительный контроль) инфекционного материала от больсерий полиовирусного антигена (отрицательный контроль) абс.ч. абс.ч. абс.ч. в т.ч. с

ПОЛОВИКИ» тельным в т.ч. с полоки» тельньв1 в т.ч. с полови тельным результатом результатом результатом

47

47

17

17

8

8

5

0

0

8 5

Таблица 2

164 . 38,4+3,8

66 55+6

, Спорадические больные

Больные из очагов

162 2,7 2+3 5

71 48+6

Таблица 3

Расчет-обоснование зкономической эффективности предлагаемого способа определения ротавирусных антигенов

Сникенне затрат в (раз) при использо ванин реагента

Реагент личество реагентов бходимое для нседования 100 обцов, мл

Один Многораз кратно длагее- Извествеий ньа1 (5) 1Ьмуипая сьюоротка

Диагностические антитела против глубудинов кролика, Субстрат

28 5>6 28

28 5,6

2 0X -"3эoX -"На вводили

Тип ферментной метки

Антитела диагностические против глобулинов кроликов меченные пероксидазой 47

Антитела антипероксидазные в комплексе с пероксидазой 47

Контингент обследованных

Исследовано образцов

Обнарукенне ротавирусных антигенов в пробах через, ч ю

5 28 5,6 28