Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента сыворотки крови человека

Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента сыворотки крови человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине , а именно к иммунологии, s частности к функциональной диагностике. Цель изобретения - сокращение числа операций и повышение точности способа определения гемолитической активности третьего компонента комплемента . Под действием третьего компонента комплемента испытуемой сыворотки,смешанной с реагентом, в качестве которого применяется донорская сыворотка с инактивированным третьим компонентом комплемента, в термостатированных кюветах при 37 С происходит гемолиз сенсибилизированных эритроцитов барана , который записывается во времени на самописке. Способ может использоваться з качестве диагностического теста при оценке состояния гуморального иммунитета при трансплантации органов и тканей, в диагностике аутоимунных и онкологических заболеваний, 1 табл.

СВОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (53)5 С 01 Н 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4472524/14 (22) 05.08.88 (46) 15.05.91. Бюл. Р 18 . (71) Научно-исследовательс кий институт трансплантологии и искусственных органов (72) В.И.Пкурко, В.И. Елец, А. 3.Рачинский, О.Ю,Арапова и Б.И.Шальнев (53) 615.373 (088.8) (56) Tack BE. and Prahl I Ч. Third

component of human complement: purification from plasma and physcochemical characterization. — Biochemistry, 1976, 15„p. 4513 .. (54) CIIOCOE. OIIPEIIEIIEHIDI ГЕМОЛИТИЧЕСКОА АКТИВНОСТИ ТРЕТЬЕГО КОМПОНЕНТА

КОМПЛЕМЕНТА СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, в частности к функциональной диагностике.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, к способам функциональной диагностики.

Целью изобретения является сокращение числа операций и повышение точности, Способ количественного определения гемолитической активности третьего компонента комплемента в сыворотке крови человека осуществляют следующим . образом.

Готовят реагент-сыворотку крови человека дефицитную по третьему компоненту комплемента путем инкубации свежей сыворотки (или плазмы) с рав„„ЯО „„1 649434

Цель изобретения — сокращение числа операций и повышение точности способа определения гемолитической активности третьего компонента комплемента. Под действием третьего компонента комплемента HcnblT уемой сывор отки, смешанной с реагентом, в качестве котор or о приме ня ется донор с кая сыв ор отка с инактивированным третьим компонентом комплемента, в термостатированных о кюветах при 37 С происходит гемолиз сенсибилизированных эритроцитов барана, который записывается вс времени на самописце. Способ может использоваться в качестве диагностического теста при оценке состояния гуморального иммунитета при трансплантации органов и тканей, в диагностике аутоимунных и онкологических забол ваний.

1 табл. ным объемом насыщенного раствора бромистого калия в течение 48 ч. Далее бромистый калий удаляют диализом против веронал-мединалового буфера. Реагент сохраняет свою активность в течение двух недель при +4 С или в течение нескольких месяцев при -70 С.

Для проведения анализа готовят взвесь эритроцитов со светопропусканием 0,5 (0,49 — 0,51) на светофильтре

Р 4 фотоэлектроколориметра против физического раствора. Вносят по 5 кл этой взвеси в кюветы с толщиной светопропускания 10 мм. Кюветы помещают в термостатированные ячейки, смонти1649434 рованные на фотоэлектроколориметре, которые позволяют поддерживать температуру в кюветах 37 С. На крышке о фотоэлектроколориметра смонтированы пластмассовые мешалки, перемешивающие взвесь эритроцитов во время реакции.

В каждую кювету добавляют по 0,05 мп кроличьей гемолитической сыворотки в разведении 1:2 и эритроциты оставляют на сенсибилизацию на 10 мин (только первую пробу). Правая кювета служит контролем. В левую кювету вносят

100-400 мкл испытуемой сыворотки в разведении 1:100 или 200-400 мкл в разведении 1:40 вместе с 600 мкл реагента. Одновременно с внесением сыворотки включают запись гемолиза эритроцитов во времени на самописце, подключенном к фотоэлектроколориметру. 20

При следующем анализе правую кювету переносят в левую ячейку, а в левую кювету заливают новую порцию эритроцитов (S мл) и 0,05 мл гемолитической сыворотки и помещают ее в правую ячейку фотоэлектроколориметра. Вовремя гемолиза, происходящего в левой кювете, в правой кювете, служащей контролем, происходит сенсибилизация эритроцитов для следующего титрования.

Кинетограммы представляют собой типичные S-образные кривые. Расчет активности третьего компонента комплемента проводят по формуле

А

qKXt Ф

35 где Я - количество взятой для анализа исходной сыворотки, мкл, t — время 507.-ного лизиса мин

k. — коэффициент, постоянный при определении активности данного компонента, равный для

СЗ вЂ” 0,57, А — активность третьего компонен45 та комплемента, находящегося в 1 мл испытуемой сыворотки, способствующего гемолиэу 5 мл взвеси эритроцитов барана со светопропусканием 0,5 за

1 мин.

Время 50Х-ного лизиса находят, опустив перпендикуляр из точки деления ординаты кинематограммы пополам на ось абсцисс диаграммной ленты самописца. Линейность отношений, выражаемая используемой формулой, имеет место при достаточных разведениях испытуемой сыворотки. Третий компонент комплемента сыворотки человека наиболее точно титруется при разведении сыворотки 1:100,Разведение 1:40 используется для сывороток с активностью третьего компонента значительно ниже физиологической нормы. Для определения активности третьего компонента комплемента кинетическим методом практически достаточно получить кинетограмму для одной дозы (Q) если она достат очна для осуществления 1007.-ного лизиса эритроцитов, содержащихся в кювете. При этом затрачиваются ничтожные количества сыворотки (1-10 мкл) .

Ошибка измерения при этом не превьшиет +53. Использование дозы меньше

1 мкл приводит к затратам более

10 мии, при этом не выдерживается линейность при использовании данной ."..— формулы расчета, так как не достигается 100 -ный ли зис эритр оцит ов. Использование дозы более 4 мкл (до

10 мкл) возможно при низкой активности третьего компонента, но разведение сыворотки должно быть при этом 1:40, так как при разведении 1:100 получаются большие объемы, что ведет к нарушению физических параметров проведения реакции.

Для повышения точности определения выбрана доза реагента 600 мкл, чтобы избежать попадания на сгиб кривой при приготовлении очередного реагента, а большую дозу не использовали из-за ограниченного объема кювет фотоэлектроколориметра (примерно 7мл) и из зкономических соображений.

В таблице приведен. сравнительный анализ осуществления предлагаемого способа и способа-прототипа.

По сравнению с базовьи объектом предлагаемый способ значительно проше, так как не требует применения чистых С1 и С4, и быстрее, так как. используется 1 разведение испытуемой сыворотки, а не серийные разведения, требующие измерения каждой пробы из этой серии на ФЭКе. Кроме того, для быстроты расчетов для самописца с определенной скоростью движения ленты на ЭВИ можно рассчитать активность

СЗ для ряда доз испытуемой сыворотки и различного времени гемолиза, используя предлагаемую формулу расчета.

Тогда для получения результата необходимо только измерить расстояние от стартовой линии (начало реакции) до точки 50Х-ного гемолиза на кривой ли5

1649434 6 зиса и по таблице найти активность чающийся тем, то, с целью

СЗ. сокращения числа стадий и повышенияточности, сыворотку смешивают с реагентом в соотношении (1 — 10):600, а

5 сенсибилизированные эритроциты используют без комплекса с С С1, регистрацию степени гемолиэа осуществляют по оптической плотности на кинетической кривой и по 50Х величине гемолнэа рассчитывают активность С компонента комплемента.

Сравниваемые приз- Предлагаемый наки способ

Спос об-пр от отип

Не определяется

Определяется из-за большей

Остаточная активность РЗ, приготовленному пс прототипу чувствительности способа

Не определяет- Не определяся ется

Остаточная активность РЗ, приготовленному по предлагаемому способу

Использование чис- Исключается. тых С1 и С4 компоНеобходимо нентов

Количество испытуемой сыворотки

1-4 мкл 1 раэ- Серия разве) ведение де ний (10- 20) по 50 мкл

1 проба — 10 мин 1 ч

Время инкубации

Измерение гемолиза

Запись кинетограммы гемолиэа ЭБ на самописце, подключенном к ФЭКу от 1 пробы 515 мин

Лктивность С3 гемоли з

Формула и зобр ет ения

Способ определения гемолитической активности третьего компонента комплемента сыворотки крови человека путем ее разведения с последующим смешиванием с реагентом дефицитным по третьему компоненту комплемента и . сенсибилиэированными эритроцитами барана, регистрации степени гемолнза в пробе и расчета активности, о т л иРассчитывается по формуле °

Выражается как в еличина, обратная произведению времени 50Х-ного гемолиза на количество образцов (в ед.

СН, 50) Измерение гемолиза на

ФЭКе серии проб с разными разведениями сыворотки (примерно

1 ч) Выражается как величина, обра тная р а зведению образца, при котором наступает 50Л-ный