Рекомбинантная плазмидная днк р7,5с, кодирующая антиген вируса гепатита в, и способ ее конструирования

Рекомбинантная плазмидная днк р7,5с, кодирующая антиген вируса гепатита в, и способ ее конструирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при получении живой рекомбинантной вакцины против гепатита В. Целью изобретения является создание плазмиды, обеспечивающей экспрессию антигена вируса гепатита В в клетках млекопитающих.Рекомбинантная плазмидная ДНК р 7,5 С состоит из Sty 1 - фрагмента генома вируса гепатита В (ВГВ) длиной 575 п.о.. содержащего С-ген ВГВ без АТС кодона и большей части pre-облзг.ти (для обеспечения инициация трансляции непосредственно с ATG-кодона С-тена). и вектора р VAR 15, обеспечивающего интеграцию и экспрессию С-гена в составе гена тимидинкиназы вируса осповакцины ЛИВП.

СОГО СО ВГ:ТСКИХ

СОЦИЛЛИСТИЧГСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К АВТОРСКОМУ, СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В»

»»

ГРСУДЛРСТОГННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 07.07„93. Бюл.. Р 25 (21) 4746353/13 (22) 27,07,89 ,(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственное обьединения "Вектор" (72) А.С.Беляев, И.П.Дмитриев, МЮ,Рукавишников и А,Н.Синяков (56) Nature, 1983, ч.. 302, р. 490-495. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК р 7,5 С, КОДИРУЮЩАЯ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА Вт И СПОСОБ ЕЕ

КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к медицине, биотехнологии и генетической инженерии и

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при получении живой рекомбинантной вакцины против гепатита В.

Целыр изобретения является создание плазмиды, обеспечивающей экспрессию антигена вируса гепатита В в клетках млекопитающих, Для этого сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК р 7.5 С, кодирующая синтез HBc Ag для вакцины против гепатита S, и состоящая из фрагмента гено- ма вируса гепатита В, плазмидного вектора р VAR 15. обеспечивающего встройку и экспрессию С-гена в гене тимидинкинаэы вируса осповакцины, синтетических фрагментов ДНК (линкеров). связывающих

С-ген с плазмидным вектором. В качестве линкеров, обеспечивающих состыковку С-гена с вектором pVAR 15 используют синтетические фрагменты ДНК

„, SU „„1á51555 А может быть использовано при получении живой рекомбинантной вакцины против гепатита В. Целью изобретения является создание плазмиды, обеспечивающей экспрессию антигена вируса гепатита В в клетках млекопитающих, Рекомбинантная плазмидная ДНК р 7,5 С состоит иэ Sty 1— фрагмента генома вируса гепатита В (ВГВ) дли- . ной 575 п.о,. содержащего С-ген ВГВ без ATGкодона и большей части рге-области (для обеспечения инициации трансляции непосредственно с АТО--кодона С-гена}. и вектора р VAR 15, обеспечивающего интеграцию и экспрессию С-гена в составе гена тимидинкиназы вируса осповакцины ЛИВП, СЛТСС С TC(ACC

Я ЛфУ.

ССЛССТСССЛЛС

САТССС ГССДСС (П) УФФУ

ССАСС ГСССТТС

Для получения р .5 С выделяют фрагмент ДНК, содержащий С -ген вируса гепатита В, удаляя при этом ATG кодон рге-С области, состыковывают этот фрагмент с 7,5 к промотором вируса осповакцины, окруженным участками гена тимидинкиназы этого вируса, полученную плазмидную ДНК используют для получения рекпмбинантного вируса осповакцины V 7,5 С на основе вируса осповакцины штамма ЛИВИ.

Экспрессию НВс Aq осуществляют в клетках животных CV-1 при инфицировании их рекомбинантным в рус0M осповакцины

1651555 полученным на основе укаэанных компонентов. Индикацию экспрессии осуществляют методом иммуноферментного анализа, Во всех пробах обнаруживают антиген вируса гепатита В. причем уровень экспрессии последнего составляет 600 нг на

10 инфицированных клеток зв 48 ч при полном цитопатическом действии, что позволяет рассматривать полученную плазмидную

ДН К как субстанцию, потенциально пригодную для изготовления вакцины против гепатита В.

Пример 1, Способ конструирования рекомбинантной плаэмидной ДНК р 7.5 С.

В качестве источника С-гена вируса гепатита В используют плазмиду pGC 75, содержащую Hha1 фрагмент ДНК вируса гепатита В субтипа аун.

50 мкг плазмиды зр,ОС 74 расщепляют в реакционной смеси, содержащей 100 ед.

StyI — зндонуклеаэы, 30 мМ трис-WCI рН 7,5, 7,5 мМ MgCI2, 50 мМ NaCI, 7,мМ Р-меркаптоэтанол в течение 1 ч при 56 С, После этого фрагмент ДНК длиной 575 п,о., содержащий

С вЂ” ген, выделяют методом электрофореэа в агарозном геле с последующей электроэлюцией на диалиэную мембрану.

Отдельно расщепляют вектор pVAR 15

8arnH1-эндонуклеазой в стандартных уоловиях, инактивируют ее прогреванием при

68 С 30 мин и лигируат BamHI — линеариэованный вектор с 50-кратным избытком линкеров 1 и П, Линейную форму р VAR 15 с пришитыми линкерами отделяк т от свободных олигонуклеотидов методом электрофореза с последующей злюцией на диалиэную мембрану.

5 мкг BamHI — линеаризованной формы р VAR 15 с пришитыми линкерами лигируют с 1 мкг Sty i — фрагмента плазмиды pGC 74 (575 п.о.), полученной лигазной смесью трансформиру от компетентные клетки

Е.соИ Н В 101. Трэнсформанты анализируют на наличие встроенного фрагмента рестриктазами Вагп Hl u SalGI. Все 24 отобранных трансформанта содержат искомый фрагмент. Ориентацию фрагмента относительно вектора определяют при помощи гидролиэа рестриктазами ХЬа! (фрагменты 1031 и 4021 п,о,). а также Оа/Bgi tl (фрагменты 427, 439, 742 и 3444 n,o.). Г1олученная таким образом плаэмида обозначена р 7,5 С.

Пример 2. ДНК плазмиды р 7,5 С используют для трансформации клеток почек зеленой мар гышки СЧ-1, зараженных вирусом оспонакцины штамма ЛИВП, Урожай вируса после трансформации нысонают на монослой переоиоземой линии клеток кры сы R at 2 (IK-). В присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуоидина от,3Mpa ot вирусные клоны методом ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах с P меченым Sty! — фрагментом

Л (575 п.о,). содержащим нуклеотидную последовательность С-гена. Таким образом про5 веряют наличие этой последовательности в клонах, Положительные по гибридизации клоны вируса оспонакцины наращивает на

CV -! или R at 2 клетках на среде ИГЛА МЕМ с 2$ сыворотки новорожденных телят. В

10 пробах, содержащих клеточные лизаты и культуральные жидкости, определяют наличие антигена вируса гепатита-В иммунофер- ментным методом с пероксидазой хрена, при этом в качестве контроля сраонения ис15,пользуют рекомбинантный HBcAg, полученный в E.coll. Bo всех пробах обнаружен антиген, причем уровень экспоессии последнего составляет 2000 нг на 10 инфици. рованных клеток CV-I за 48 ч при полном

20 цитопатическом действии, что позволяетрассматривать полученную плазмидную

ДНК как субстанцию, потенциально пригодную для изготовления вакцины против гепатита В.

25 Пример 3. Клеточный иммунный ответ определяют с помощью общепринятой реакции бласттрансформации лимфоцитов . (РБТЛ). Для этого иммуниэируют подкожно в корень хвоста линейных мышей ВА В/ с

30 массой 8-10 r дозой 2-4 х 10 о,о. е/мышь.

Спленоциты выделяют на 9-е сутки после иммунизации для постановки РБТЛ, трижды отмывают и вносят в 96-луночные платы по 10 спленоцитон на лунку. Культиб

35 вируют в течение 4 сут 5;ь СО с добавлением митогенов: неспецифического конканавалина А и специфических — инакативированнсч о вируса осповакцины ЛИВП и антигена оируса гепатита В, 40 Результаты оценивают по включению

Н вЂ” тимидина, добавленного за 18 ч до з окончания культивирования в дозе 1 мкКи на лунку. Контролем служат лун"": с образцами спленоцитоо без митогена.

45 Рассчитывают коэффициент РБТЛ по отношению радиоактивности в опыте к радиоактивности в контроле.

Рекомбинант V7,,5 индуцирует образование клонов лимфоцитоо, сенсибилизиро50 ванных к антигону вируса гепатита О, что указывает на наличие выраженного специфического T-клеточного иммунного ответа у жинотнык, иммунизированных штаммом. по сряонению с интактными мышами и имму55 низираванными ЛИВГ1, Таким образом, с помощнее плазмиды р

7,5 С получен рекомбинантиый вирус осповакцины, обеспечивающий экспрессию

НВс-гена вируса гепатита О в клетках мпекопи ающих.

1651555

GATCCG Ò CGA|.C

GCAG CTG G G.С

Составитель T.Çàáoéêèíý

Редактор Л,Лашкова Техред М.Моргентал Корректор M.Øàðài:tè

Заказ 2832 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Г!этент", r. Ужгород, ул.р-.iàð н;а. 1"!

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК р 7,5 С, кодирующая антиген вируса гепатита В размером 5052 п.о., содержащая;

Sty - Sty — фрагмент ДНК вируса гепа- 5 тита В размером 575 п.о.;

Bam Н1 фрагмент фрагмент ДНК вектора р VAR 15 размером 4453 п.о„ синтетический фрагмент ДНК (линкер) длиной 12 п.о., имеющий структуру 10 генетические маркеры и гены;

Amp — ген устойчивости к ампициллину;

tk — ген тимидинкинаэы вируса осповакцины со встроенным 7.5 к промотором вируса осповакцины; уникальные сайты эндонуклеаз ре- 25 стрикции

Н!пб III-сайт — между последовательностью ДНК плазмиды pBR 322 и последовательностью гена тимидинкиназы вируса осповакцины, Pst — сайт в гене ампициллинрезистеитности;

Sma и Есо Rl — сайты между последовательностью ДНК вируса гепатита В и последовательностьюю гена тимидинкинаэы вируса осповакцины.

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК р 7,5 С, заключающийся в том, что ДНК плазмиды р VAR 15 расщепляют рестриктазой BamHI, лигируют с линкерами

СлтССОТССАСС

////////

ССАССТСССЛАС

GATCCGTCCACC

II I III(!

GCA ССТССбТТС очищают с помощью электрофореэа, лигируют с Sty -I фрагментом ДНК плазмиды

pGC74, имеющим размер 575 п.о„лигазной смесью трансформируют клетки E.coH HB

101, отбирают трансформанты, несущие фрагмент ДНК плазмиды pGC74, выделяют иэ них плазмиду р 7,5 С.