Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей и штамм водоросли снlоrеllа sp-продуцент углеводов

Способ отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей и штамм водоросли снlоrеllа sp-продуцент углеводов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов, в частности к получению углеводов. Целью изобретения является повышение эгЬЛечгивности отбора регуляторных мутантов фотосинтеэирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей и выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилизируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапе резистентных к селективному агенту мутачтных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результате данного способа получен новый штамм водоросли Chlorella sp. C-/5, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. Полученный штамм синтезируют до 60% углеводородов. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 5 табл. 3 (Л 0 ел 4ь со со 1

СОЮЗ СОВЕТСКИ)(COU

РЕСПУБЛИК (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П(НТ СССР (21) 4260256/13 (22) 11.06.87 (46) 07.06.91. Бюл. Р 1 (71 ) Институт фи з и оло гии р зс те ний им. К.А. Тимирязева (72) В.E.Ñåìåíåíêî и Л.А.!1)итова (53) 576.8(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 627163, кл. С 12 N 15/00, 1978, Семененко В. F. Механизмы эндогенной регуляции фотосинтеза и адаптивные свойства хлоропласта. В кн.: Физиология фотосинтеза, М., 1982.

Покровский A.À. Белки одноклеточных. (54) СПОСОБ ОТБОРА РЕГУЛЯТОРНИХ МУТАНТОВ ФОТОСИНТЕЗИРУ10ЩИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И WfAMM ВОДОРОСЛИ CHLORELLА

БР. — ПРОДУЦЕНТ УГЛЕВОДОВ (57) Изобретение относится к селекции микроводорослей и может быть ис— польэовано в биотехнологии фотоавтоTpoAHblx биосинтезов, в частности к получению углеводов. Целью изобретения является повышение эдне;тивносИзобретение относится к селекции микроводорослей и может быть использовано в биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов.

Целью изобретения является повьппение эффективности отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повьппенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. рц С 12 N 15/01, 1/1 .;

А 11 G 33/00, С 1, Р 19/)4 ти отбора регуляторных мутантов фотосинтезирующих микроводорослей с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата и получение штамма, обладающего более высоким синтезом углеводов. Способ заключается в том, что проводят последовательное проведение двух этапов селекции микроводорослей и выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналога глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДГ) в количестве, полностью подавляющсм рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на 1-м этапе реэистентных к селективному агенту мутантных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. В результате данного способа получен новый штамм водоросли Chlorella sp. С-75, депонированный в коллекции микроводорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева. Полученный штамм

cHHTeзируют до 607 углеводородов.

2 с.п.h-лы, 2 ил., 5 табл.

Сверхпродукция фотосинтеза в данном случае является следствием нарушений регуляторного механизма, действующего по принципу отрицательной обратной связи, где роль эффектора выполняет один из конечных продуктов фотосинтеза — глюкоза.

На фиг. 1 изображен уровень репрессии карбоангидраз ной активности аналогом глюкозы, на фиг. 1 — синтез

1654331 углеводов известным штаммом и штаммом

Chlorel1а sp. CRS-03 2дДГ яes

Способ предусматривает последовательное проведение двух этапов селек5 ции микроводорослей: выращивание колоний на питательной среде с добавлением неутилиэируемого клеткой аналога глюкозы (2-деэокси -Д-глюкозы, 2дДГ) в количестве, полностью подавляющем рост исходной культуры, и культивирование всех полученных на первом этапе резистентньм к селективному агенту мутантных клонов на среде, содержащей глюкозу, в темноте. 15

Известный из практики селекции микроорганизмов прием отбора мутантов с нарушениями механизма регуляции

Продуктивности некоторых ферментов глюкозой, состоящий в выращивании культур на питательной среде с 2дДГ, обычно приводит к получению достаточно широкого спектра мутантных форм и нуждается в последующем длительном отборе клонов с целевыми свойствами. 25

Учитывая то, что у фотосинтезирующих микроводорослей рост колонии на

2дДГ может быть обусловлен в основном двумя причинами — нарушением регуляции уровня фотосинтеза и мутациями по белку — переносчику глюкозы, для массового "отсева" второй группы мутантов (нерегуляторного характера) в предложенном способе клоны, реэиатентные к 2лДГ, сразу переносят на питательную среду с глюкозой (1X), инкубируют их в течение 3-5 сут в темноте.

Благодаря введению второго этапа селекции, представляющего собой до- 4О статочно простую и нетрудоемкую процедуру, удается добиться существенного роста эффективности отбора регуляторных мутантов с повышенным уров" нем продукции фотосинтезирующего an- 45 парата, а именно, более 80Х полученных предложенным способом клонов демонстрируют ту или иную степень сверхпродукции фотосинтеза.

Иэ отобранных новым методом мутантов получают соответствующие мутантные штаммы хлореллы, в т.ч. и штамм

Chlorella вр, " продуцент углеводов.

Вновь полученному штамму присвоили номер CRS 03-2дДГ . 16гамм депоЯеь

55 нирован в коллекции одноклеточных водорослей Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева под номером

С-75.

Морфологические признаки штамма, Темно-зеленые клетки с гладкой поверхностью, шаровидной формы, на агаризованной среде Тамийя, размер клеток равен 4,5-5 мкм. Клетка содержит небольшое ядро и крупный чашеобразный хлоропласт. Размножение вегетативное.

Физиологические признаки. Оптимальньии условиями для выращивания является среда Тамийя, в качестве источника углерода использует углекислый газ, бикарбонат, гаэовоздушную смесь, содержащую 1,5-2 углекислого газа, в качестве источника азота — мочевину, рост при 35-37 С.

Отношение к освещенности. Требует круглосуточного освещения.

При описанных условиях накопление биомассы составляет 3, 1 мг/мл, скорость роста составляет 280<10 ????.>

При культивировании штамма на среде Тамийя нли на среде Тамийя без источника азота при рН среды 6,3, температуре 42 С, круглосуточном освещео нии 40 Вт/м получают биомассу, содержащую 60 углеводов. Штамм устойчив к контаминации, агглютинации и автолиза не наблюдается, имеет маркерный признак — рост на среде с 2 дДГ и глюкозой (в темноте) .

Штамм поддерживают на агаризованной среде Тамийя при 27-28 С, освещенности 4 эрг/см . Хранят при 1012 С, освещенности 0,4 эрг/см .

П р и и е р 1. Суспенэию клеток

СЫ.orella зр. К с концентрацией 2х х10 кл./мл наносят на агаризованную среду Тамийя с добавлением 0,250,5 2дДГ, которая полностью подавляет рост исходной культуры, и равномерно распределяют по поверхности шпателем. Такой же гаэоновый засев делают на контрольной чашке, т ° е. без

2 дДГ. Появившиеся на опьггной чашке колонии рассевают на агариэованную питательную среду Тамийя с глюкозой (1X) и помещают в темноту в термостат при 36 С. Колонии, растущие в этих о условиях в течение 3-5 сут, анализируют затем на способность к накоплению продуктов фотосинтеза.

В данном случае иэ 11 реэнстентньм к 2 дДГ мутантов лишь 7 обладают способностью расти в темноте на среде с глюкозойе

«Ь 5433 ге»»ой и»же»ерин

Данные роста резистентных K .? дДГ мутантов Chlorella sp. на разл»нных средах приведены в табл. 1.

Пример 2. Для создания усло5 вий направленного синтеза уг;.)енодон

Ch1 or el l a sp. Ê полученные мута и гы помещают в сосуды для интенсинногo выращивания на питательную среду Та мийя без азота. Барботиронание культур осуществляют газовоэдуш»ой смесью с 27 СО, выращивание проводят при

ЗЬ С. Освещение 5 ) Вт/м круглосуточное. Иачальная концентрация клеток н

1 мл 111х10 15

Содержание углеводов в исходной культуре и культурах мута»тон определяют методом Аенол-серная кисло а.

Через определенные интервал:i времени отбирают O,t)5-«),1 мл успе»эии, ?О добавляют 0,1)5 мл 8«)7-ного pacTI!opa фенола и 5 мл конце»;рирона»»ой 1 . (<

Оптическую плотность oxpattle»»t?t.o ра:твора измеряют на Аотоэлектроколориметре с использованием Аильтра с максиму- 25 мом пропускания 490 нм.

Количество углеводов рассчитывают по градуировочной кривой, предварительно составленной по глюкозе. Полученный конечный продукт имеет следую- 30 щий состав, 7.: водopacTI«opHMbte сахара

5; крахмал 80; гемицеллюлоэа 3; клетчатка 1-3.

Сравнительная характеристика »акопления углеводов в клетках исходного

35 и мутантных Chlorella CRS 5 и Clllcirella CRS 10, Chlorella СКБ «)3 2д",Г "сз штаммов в условиях роста без аэота приведена в табл. 2 и 3.

П р и M е р 3. Другим факт opo 1 40 вызывающим напранленный синтез угле;одов, является экстремаль»ая температура 43 С. Исходную культуру и муг;»ты выращивают»а полной среде Тами««я при ЗЬ С, при круглосуточ»о«-; освеще- 45 нии (50 Вт/м ) и непрерывном барботировании газовоздушной смесью C,?7 СО, а затем переводят в условия экстремальной температуры 43 С. Содержание углеводов определяют тем же мстодом, 5Q что и в примере 2. Результаты анализа представлены в табл. 4 и 5.

Пример 4. Одним из доказательств, указывак««цих нз то, чтс. С»1оге11а нР.СЕЯ 03 2дЛà — регуляторный мутант с нарушенным меха»измом негативной метаболитной регуляции Аотосинтеза на уровне экспрессии генома хлоропласта является отсутствие ч

7 6

«?епр е с сии ан «!Io го?1 ;1««?к о 311 (1. д, !1 )

Г > фе",,мe»òa, кодируемого и хл<.ропласгНоМ ге««о«е — хлоропластной карбоа»i itдра эы.

С1?1огеl .. sp. K и мутант культивируют г ., IoBEI»x и»генсинной культуры при постоя н»ом освещении и непрерывНоМ барботиронани«: гаэоноздушной сМе с»ю с;.4 СО . Культуру нь«ра«Н1нают до

11»от»ос г«1 71) 1 )«) ы1» кле гок н 1 MII + пос.« . Чсго вносят сте1?1«льную д Г

«со««це1«грац»«т 1), ?Х. Акт«11 1«ость карбоангидр» 1. nit)? e;tcляь?т электрометрическим мего«тг, 10 1«э?«е»с 1н«ю р8 н процессе ро:lкц«««1 »дратв»ии С«1 . 1 онтролем с?л«уул,. «т с "-.«э«1матическая р еакция .

)с«. »:«д::. » э t»tr. 1, при проникноне«1»» н клегкit микрон одоросли 2 дДГ акти» «ость хлоро:.ласт»о» карбоангидраэы i 1 сходной Аормы Chlorella sp.Ê ропрсс »руется до 5,7 ?, а у Cltl.orel

1» sp. t;i .S )3, ? д1Г ез остается на

5wc oItd?t gpor«Hc с ос та Вляя 8Ь ", QT Нсход««о г о э««ач е ни я .

Так««м образом, из приведенных примеров следует, «то предложен»«ый способ < « I.кц«п« с!«Cспечинает гораздо ме»не - рудоемкий il б lc Tpl lit а следователь «о, » бо««е» эЫ«ектин»1«г« чем н случае протот««па отбор регуляторных мутант ?н с IIQB«1«««с»»ой продуцирующей способ««остью: >отосинтет«1«ескогс àïïàpara, оглича«?11 «хся грс.««де всего более нь«сок«1?111 ноэмож» ?стями в плане накоп— ле»1«я 1«к:«с тках yr!Ie»n;Iot« .

В i«ac TitocTII благодаря ис»ольэона»ию 1:р сдлагас;:ого спс соб» получен штамм Ch1 огеl l 1 sp. СЕБ )3 2дД1 .Res прод. цент углеводов.

Приме« ение иэобретс«»«я н биотехнологi»t АотоантотроА«н к биоси»тезов

Hoaiio:11«т пол -;ать более н:"«сокие выходы прод кгон 8«oToctt«ITeaa — полисахаридон (крахмал) с еди»ицы суспенэии, а также использовать данные мутанты для исследования молекулярных механизмов регуляции экспрессий генома хлоропласта и для констру»рования нон«,«х продуцентов на основе методов Э о р м у л а и э о б р е т е н и я

1, Способ отбора регулятор»ых мута»тон фотосинтеэирующих IIIKpoBoJTopoc— лей„. нключающии выращинаь»1е культур н присутстнии селективного агента

2-дезокси-Д-гпюкоэь; B !

5 с повышенной продуцирующей способностью фотосинтетического аппарата, поТаблица 1

Chlorella sp. (2дДГ )

RC8

Среда

Глюкоза (17) Тамийя + 2дДГ (0,57) Тами йя вет Темнота

Т а б л и ц а 2

r Содержание углеводов, мг/мл, эа время инкубации, ч

Штамм

Прирост за

44 ч

О 22 44

Ch1ore1la sp.К

Chlorella sp.

CRS 5

Chlorella sp.

CRS 10

0,145

0,142

О, 134

I), 4.)4 ), 442 ), 437 ),445

0,817

О, 795

t), 30 ) 0,6/5, ), 661

Таблица 3

Содержание углеводов, мгlмл, за время инкубации, ч

Прирост за 64 ч

0 16

О, 148 О, 390

О, 133 О, 314

О, 390 О, 242 ),604 0,471

Chlore11a sp. К

Ch1orella sp.

CRS 03 2 ДЛГйе9

СЬ1 огеl lа

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

Chlorella

sp. CRS l)3

sp. GT-1

sp. GT-2

sp, CRS 2

sp. CRS-3

sp. CRS-4

sp. CRS-5

sp. GT-7

sp. GT-8

sp. GRS 10

sp. GRS UV лученные резистентные к селективному агенту клоны подвергают вторичной селекции на питательной среде с глюкозой в темноте.

2, Штамм водоросли Ch)оre11à sp.

1<ВИФР Р С-75 — прадуцент углеводов.

1654337

Содержание углеводов, мг/мл, за время ннкубации, ч

Штамм

Прирост, 7

0 19 42

100 ), 380

149

118

157

Chlorella sp. CRS 03 2д1Г

Re зя время инкубяции, ч

Chlorellp sp. К, за время инкубации, ч

Параметры

9S,8

157,5

58,7

68,8

68,7

137, 5

1,25

0,26

1,75

1,11

О, 5()

0,85

0,62

0,90

0,603

О, 737

i), 134

0,604

0,405

О, 195 без 2дД

4ыг. f

П исходная кулътура

El мутант

Chlorel 1 a sp. К

Chlorella sp

CRS 2

Chlorella sp.

CRS 3

Chlorella sp.

CRS 4

Число клеток

Вес сухой массы, Mr/мл

Вес клетки, мг

Количество углеводов, мг/10 кл.

О, 149

0, 131

0,125

О, 140 ), 263

<),27Л ), ".80

i), 29 ) ), 358 ), 35 ) ), 37 )

О, 385

Тяблица4

0,567 ), 450

l), 600

Т а б л и ц я 5

1654337

/. Е креня. и

Составитель Т.Полянская

Редактор Н.Гунько Техред Л.Олийнык КорРектоР М.Самборская

Заказ 1930 Тиралс 393 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101