Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона

Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к получению ферментов, в частности нейтраминидазы холерного вибриона . Целью изобретения является упро щение и ускорение способа, а также увеличение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что используют штамм Escherichia coli HB 101 pRD 39 № 124, содержащий гены нейраминидазы холернсмо виб риона. Культуральную жидкость диализируют против дистиллированной воды, концентрируют и очищают гельфильтрацией с использованием трехкомпонентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1. Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфе ром, рН 5,6. Удельная активность целевого продукта 4300 ед/мг, выход по активности 83%, время очистки 1,5 - 2 ч. Продукт гомогенен по данным ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Na. 2 ил. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю С 12 N 9/24

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

3 (21) 4669120/13 (22) 27.03,89 (46) 15,06,91. Бюл. ¹22 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Н.Я.Шиманюк и Б.H,Мишанькин (53) 577. 15,07 (088.8) (56) Патент США № 4071408, кл. С 12 N 9/24, 1978.

Вертиев Ю.В., Езепчук Ю.В„Абрашев

И,P., Хорлин А.Я., Краснова И.H. Выделение и характеристика нейраминидазы, продуцируемой неагглютинирующим вибрионом.—

Биоорганическая химия, 1975, Т.1, ¹ 11, с, 1639 — 1645. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ХОЛЕРНОГО

ВИБРИОНА

Изобретение относится к биотехнологии, к получению ферментов, частности ней.раминидазы холерного вибриона.

Целью изобретения является упрощение и 1 корение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Способ заключается s том, что используют штамм Escherichia соН Н В 101 pRD 39, № 124 (коллекция государственного научнаисследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.A.Тарасевича), содержащий гены нейраминидаэы холерного вибриона. Культурал ьную жидкость штамма кишечной палочки диализуют против дистилированной воды, концентриру„„ 42, 1655987 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментов, в частности нейтраминидазы холерного вибриона. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа, а также увеличение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что используют штамм

Escherichia coii НВ 101 pRD 39 ¹ 124, содержащий гены нейраминидазы холерного вибриона. К.ультуральную жидкость диализируют против дистиллированной воды, концентрируют и очищают гельфильтрацией с использованием трехкомпонентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении

1:1:1. Элюцию ведут 0,01 M ацетатным буфером, рН 5,6. Удельная активность целевого 3 продукта 4300 ед/мг, выход по активности

83, время очистки 1,5 — 2 ч. Продукт гомогенен по данным ЭФ в ПААГ в присутствии

ДДС-Na. 2 ил.

° ют, затем разводят и очищают гельфильтрацией с использованием 3- компонентной фильтрующей системы упьтрагелей

АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1. Элюцию ведут 0,01 M ацетатным буфером, рН 5 6.

На фиг.1 показан профиль элюции фермента при фильтрации культуральной жидкости E соП 124 через ультрагели АсА, где 1 — оптическая плотность при 280 нм, 2 — нейраминидазная активность, Пример 1. Культивирование штаммапродуцента осуществляют глубинным способом в колбах на 3000 мл. содержащих

500 мл бульона Хоттингера с 0,1 хлористого кальция, рН 7,2 при шуттелировании и

30 С в течение 8 — 10 ч. В питательную среду

1655987 вносят 5 об. $ 18- часового посевного материала Е.соН М 124, выросшего на среде этого же состава. После выращивания клетки отбрасывают центрифугированием, а культуральную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют или концентрируют любым доступным способом в 7 — 10 раз.

Для очистки 3 г лиофильно высушенного фильтрата Е.coll М 124 растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и наносят на колонку (2х100см), заполненную последовательно ультрэгелями АсА 34:44:54 в соотношении 1.1;1 и уравновешенную 0,01 M ацетатным буфером, рН

5,6, Скорость элюции 60 мл/ч, объем фракций 5 мл. Нейраминидаза опережает пигмент и связанные с ним низкомолекулярные белки и выходит четким, компактным пиком активности. Фракции, обладающие нейраминидазной активностью, объединяют и анализируют чистоту s электрофорезе полиакриламидного геля.

Нейраминидазную активность определяют тиобарбитуровым методом, За единицу активности принимают также такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты от овомуцина-белка куриных яиц в течение

15 мин при 37 С.

Удельная активность полученного фермента 4300 ед/мг, Выход по активности

83 .

Таким образом, благодаря эффекту "до5 зы гена" в клетках предлагаемого штаммапродуцента Е,coll hh 124 получают высокоактивную культуральную жидкость (суммарный выход фермента определяется

-активностью исходного препарата), а ис10 пользование для очистки 3- компонентной фильтрующей системы ультрагелей позволяет одноэтэпно получить гомогенный препарат нейраминидэзы холерного вибриона в течение 1,5 — 2 ч.

15 На фиг.2 приведены результаты электрофореза в 12ф,-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфатэ натрия, подтверждающие гомогенность полученного препарата нейраминидазы, 20 Формула изобретения

Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона, включающий очистку культуральной жидкости культуры продуцента, отличающийся тем, что, 25 с целью упрощения и ускорения способа и увеличения выхода целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма продуцента Escherlchia coll ГИСК hh 124, а очистку ведут гель-фильтрацией через сис30 тему ультрагелей АсА 34:44;54 в соотношении 1:1:1.

1655987

70,8

Н,2

21,5

1Ф,Ф

Составитель А. Семенов

Редактор Т. Лазоренко Техред M.Mîðãåíòàë Корректор С; Шевкун

Заказ 2030 Тираж 366 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101