Штамм гриба fusаriuм охysроruм (sснlеснт)snydет hans для определения устойчивости сои к фузариозу
Патент 1661206
Авторы
Классы МПК
Штамм гриба fusаriuм охysроruм (sснlеснт)snydет hans для определения устойчивости сои к фузариозу
Иллюстрации
Реферат
Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм гриба FUSARIUM OXYSPORUM для получения инокулюма для искусственного заражения сои, используемого при селекции ее на устойчивость к фузариозу. Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом фузариевой кислоты и более высокой вирулентностью по отношению к сое. Штамм выделен из природных изометов грибов FUSARIUM OXYSPORUM, вызывающих фузариоз всходов, поражение стебля и увядание сои. Штамм гриба FUSARIUM OXYSPORUM (SCHLECHT) SNYD ET HANS 690 - 10 депонирован в коллекции ВНИИСХМ под N 35. Синтез фузариевой кислоты на 14 сутки на среде Чапека составляет 84,9 мкг/мл, а у природного - 40,8 мкг/мм, вызывает поражение корня сои сорта Букурия - 34 мм, сорта к - 8409 - 9,0 мм. 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4666757/13 (22) 27,03.89 (46) 07.07;91. Бюл. № 25 (71) Институт экологической генетики АН
МССР (72) Ж. Г.П роста кова, Л. С ..Ко рецкая и А.И.Бронштейн (53) 632:576.8(088.8) (56) Простакова Ж.Г. и др. Патогенная микрофлора сои /возбудители и источники устойчивости, 1986, 17 — 19, 57. (54) ШТАММ ГРИБА FUSARIUM
0XYSPORUM (SCHLECHT) SNYD ЕТ HANS
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ
СОИ К ФУЗАРИОЗУ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм гриба Fusarium oxysporum для получения
Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм гриба Fusarlum oxysporum для получения инокулюма для искусственного заражения сои, используемого при селекции ее на устойчивость к фузариозу.
Цель изобретения — получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом фузариевой кислоты и более высокой вирулентностью по отношению к сое.
Штамм получен из природных изолятов грибов Fusarium oxysporum, вызывающих фузариоз всходов, поражение стебля и увядание сои. Путем искусственного заражения изолированных корней сои устойчивой линии к — 8409 и восприимчивого сорта Букурия по модифицирован ному методу отобран изолят F.oxysporum 690 — 10. который досто„„!Ж„„1661206 А1 (я)5 С 12 N 1/14, А 01 N 63/04 инокулюма для искусственного заражения сои, используемого при селекции ее на устойчивость к фузариозу. Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего более высоким синтезом фузариевой кислоты и более высокой вирулентностью по отношению к сое. Штамм выделен из природных изометов грибов
Fusarium oxysporum, вызывающих фузариоз всходов, поражение стебля и увядание сои. Штамм гриба Fusarium oxysporum (schlecht) Snyd et Hans 690-10 депонирован в коллекции ВНИИСХМ под ¹ 35. Синтез фузариевой кислоты на 14 сутки на среде
Чапека составляет 84,9 мкг/мл, а у природного — 40,8 мкг/мл, вызывает поражение корня сои сорта Букурия — 34 мм, сорта к — 8409 — 9,0 мм. 4 табл. верно превышал остальные штаммы природных изолятов по патогенным свойствам.
Штамм идентифицирован по определителю В,И,Билай. Депонирован в коллекции
Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под ¹ 35.
Штамм гриба Fusarium oxysporum (Schlext)Snydet Hans 690-10 имеет следующие культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки: спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретиновидно серповидные, зллиптически изогнутые или почти прямые с постепенно и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или cocosком, с 3 — 5 перегородками, Длина макроконидий — 37,4 0,29 мкм, одноклеточ1661206
40 постоянно и равномерно сужающейся, неудлиненной верхней клеткой. с ясно выраженной ножкой или сосочками, с 3 — 5 перегородками. Длина макроконидий
35,5+0,23 мкм, одноклеточных микрокони- 45 дий 8,7+0,02 мкм, Хламидоспоры обильные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.
На агаризованной среде Чапека коло50 ных микроконидий — 9,0+ 0,04 мкм. Хламидоспоры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.
Образует круглые колонии с ровными краями с диаметром на пятый день при 24О С
76,03 «0,61 мм, при 37 — 38 С 28,16«0,32 мм, при 7 — 8 С 14,2«0,34 мм. Мицелий воздушно-пушистый, фиолетово-лиловый.
Выращивание штамма осуществляют на указанных средах при 22-25 С, Морфолого-культуральные признаки культур описывают на седьмой день, характер спороношения — на 15-й день.
При выращивании штамма на сусло-агаре колонии размером 7,0--7,5 см, круглые, невысокие, с ровными краями, нежно-пушистые, с возрастом уплотняющиеся и несколько сморщивающиеся, поверхность светло-фиолетово-лиловая. обратная сторона темно-лиловая, спорообраэующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретеновидно-серповидные, эллиптически изогнутые или почти прямые с постелено и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или cocosком, с 3 — 5 перегородками. Длина макроконидий 37,4+0,29 мкм, одноклеточных микроконидий 9,0 0,04 мкм. Хламидоспоры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные, На картофельно-декстрозном агаре колонии размером 6,0 — 6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, бело-лиловые, обратная сторона темно-лиловая. Спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном ми целии, веретеновидносерповидные, зллиптически изогнутые или почти прямые, с нии размером 5,0-6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, белые, обратная сторона белая или желтоватая.
Спорообразующий, макроконидии отсутствуют, микроконидии обильные, эллипсоидальные, овальные и шаровидные, одно-, реже двухклеточные размером
5,0 — 9,0х3,5 — 5,0 мкм. Хламидоспоры обиль5
35 ные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.
Отношение к источникам углерода; усваивает сахарозу, глюкозу; отношение к источнику азота: усваивает КИОэ, ИаМОэ, казеин, соевый белок.
Температура роста; минимальная о
4 — 6 С; максимальная 37,5 С; оптимальная
22-25 С.
Оптимальное значение рН среды при культивировании штамма на твердых питательных средах 6,2-6,4; на жидких средах
5,5. Растет на средах при значениях рН среды 1,4 — 8,0.
Штамм не имеет маркерных признаков.
Штамм обладает способностью к биосинтезу фузариевой кислоты. Содержание ее в культуральной жидкости 14-дневной культуры 84,9 мкгlмл, что в 2 раза выше, чем у известного штамма (50,8 мкг/мл).
При выделении фуэариевой кислоты в чистом виде также выход приблизительно в
2 раза выше из штамма 690 — 10, чем из известного штамма.
Штамм 690 — 10 хорошо растет на суслоагаре, картофельно-декстрозном агаре и на жидкой среде Чапека при поверхностном и глубинном культивировании. При выращивании глубинным способом мицелий и конидии распределяются по всему объему среды. При стационарном выращивании образуется плотная белая пленка мицелия на поверхности. На твердых и жидких средах характер культур одинаков.
Признаки штамма устойчивы. Штамм хранят на сусло-агаре при 24 С под вазелиновым маслом 3-6 мес, затем пересевают.
Получение препарата для инокуляции семян осуществляют выращиванием штамма на сусло-агаре в течение 14 сут при
24-26 С, затем отделяют выращенную культуру от среды, измельчают на гомогенизатоое, разбавляют водой до титра спор
1х10, вносят в стерильный песок иэ расчета
50 г суспензии культуры на 500 r песка.
Песок увлажняют стерильной водой до
70 — 80% влажности, Полученный таким образом препарат используют для инокуляции семян сои, Перед инокуляцией семена стерилизуют поверхностно 96%-ным спиртом и розовым раствором КМп04 в течение 2 мин последовательно. затем промывают стерильной водой и помещают в инфицированный культурой песок на глубину 2 см, Семена проращивают в течение 5 дн при о
24 — 26 С в термостате без дополнительного освещения, 1661206
10
20
30
40
50
Патогенность выделенных из природы изолятов представлена в табл,1.
Для дальнейшего повышения патогенности штамма проведена селекционная работа, которая включает следующие этапы:
1) моноспоровый рассев исходного изолята на стандартной твердой питательной среде сусло- агар (pH 6,2 — 6,4) при 24 — 26 С, в качестве ингибитора роста колоний в среду добавляют 20 мл/л бычьей желчи;
2) искусственное заражение 30 моноспоровыми клонами изолята 690 устойчивой к фузариозу линии сои к — 8409 и восприимчивого районированного сорта Букурия, в результате чего. отобран наиболее патогенный клон 690 — 10 (табл,2).
3) проверка стабильности агрессивных свойств моноспорового клона 690 — 10 при десятикратном пассаже через растения.устойчивой линии к-8409. Для этого искусственно заражают 100 семян сои внесением
10 г культуры гриба, полученной описанным способом при 24+.1 С. Через 7 дн подсчитывают процент развития болезни по поражению проростков по стандартной шкале и из больных растений изолируют культуру возбудителя, этот прием повторяют десятикратно. Полученные результаты представлены в табл.3.
Моноспоровый анализ 10 генераций полученного штамма показал, что штамм не расщепляется по признаку патогенности.
Фитотоксическую активность (способность к биосинтезу фузариевой кислоты), как одну из составляющих патогенности, определяют s культуральной жидкости 14дневной культуры исходного штамма и полученного изолята 690-10. Грибы выращивают поверхностным способом в колбах на 500 мл (200 мл) при 24 С и рН 5,5 на жидкой среде Чапека. Содержание фузариевой кислоты в культуральной жидкости составляет для исходного штамма 40,8 и полученного штамма 84,9 мкг/мл (табл,3).
Пример 1. Хранящуюся культуру штамма 690-410 рассеивают на твердую питательную среду сусло-агар (рН 6,2-6,4) и инкубируют в термостате при 24 — 26 С в течение 10 дн. Заражение осуществляют по модифицированному методу W.À.Kendall
and К.Т.Leath, Для этого иэ семян сои испытываемых сортов, поверхностно обеззараженных 98%-ным этиловым спиртом и затем водным раствором КМп04 в течение 2 мин, выращивают пятидневные растения в стерилизованном песке, увлажненном до
70 — 80% полной влагоемкости при 25 С без подсветки. Затем срезанные и промытые стерильной водой корни раскладывают в кюветы или чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой, на них помещают диски мицелия, которые вырезают сверлом с диаметром 1,5 см. По длине гниения корня при контакте с грибом на пятый день визуально оценивают устойчивость сорта согласно разработанной шкале.
Так, сорт Букурия с длиной поражения корня 34,0 мм и Бельцкая — 82 (33,0 мм) являются сильновосприимчивыми, сорт Скынтея (15,0 мм) и Кишиневская-16 (16,0) — средневосприимчивым, линия к-28409 (9,0 мм)— устойчивой.
В табл.4 дана шкала для определения устойчивости сортов сои при искусственном заражении штаммом 690 — 10.
Таким образом, используя штамм 690—
10 гриба F.Oxydosporum с высокой и стабильной патогенностью, можно охарактеризовать уровень фузариозоустойчивости сорта по величине пораженного участка корня; чем выше данный показатель, тем ниже устойчивость.
Пример 2. Определение фитотоксической активности, Штаммы (690 и 690 — 10) выращивают в стационарных условиях при 28 — 30 С в течение 14 дн на жидкой среде Чапека следующего состава, r: КМОз 2; КН РО 1; MgS04"
7НгО 0,5; KCl 0,5; FeSO< ° 7H20 0,01; сахароза 30;; рН 5,0 — 5,5.
По 10 мл питательной среды разливают в пробирки, засевают культурой штаммов и выращивают методом поверхностного культувирования. Полученную культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин и доводят до рН 7 добавлением 1н. раствора
КОН. Содержание фузариевой кислоты определяют в полученном нейтральном растворе спектрофотометрическим методом, сравнивая интенсивности поглощения света подкисленным подщелочным растворами культуральной жидкости. Для этого к пробе
4 мл нейтрального раствора добавляют 1 мл
1н. HCI04. Максимальное различие коэффициентов поглощения кислого и щелочного растворов обнаруживают при длине волны
274 мкм. Содержание фузариевой кислоты вычисляют по формуле:
С мкг/мл = 39,3 Л Е х 274, где Š— разница экстинций подкисленного и подщелочного растворов,: содержащих фузариевую кислоту, Содержание фузариевой кислоты в культуральной жидкости штамма 690 составляет 40,8 мкг/мл, у штамма 690 — 10—
84,9 мкгlмл.
Пример 3. Выделение фузариевой кислоты.
1661206
30,1%, соответственно для исходного и полученного), а также достоверно превышает все исследованные природные изоляты.
Уровень содержания фузариевой кисло5 ты в культуральной жидкости штамма 690—
10 составляет 84,9 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем у исходного (40,8 мкг/мл). Штамм
690 — 10 может быть использован в качестве продуцента фузариевой кислоты, необходи10 мой для проведения экспериментальных исследований с токсинами грибов.
Использование штаммов, в частности
690 — 10, обладающего высокой и стабильной патогенностью, дает возможность досто15 верной оценки уровня фузариозоустойчивости сортов при применении лабораторного метода искусственного заражения для ускорения селекционного процесса.
Формула изобретения
Штамм гриба Fusarlum oxysporum (Schlecht) snyd et Hans ВНИИСХМ N 35 для определения устойчивости сои к фузариозу.
Таблица 1
Величина порахсения корня, мм повторности
Номер иэолятр
Х- и+ х
Реакция сорта
31,0 26,0 31,0
690
4,18
12,42
25,0 + 1,87
34,0+ 5,55
26,0
36,0
350 550
30,0
30,0
22,0 о
139 гзэо + Оъ5
1 ° 11
30,0
20,0 го,о
24,0
20,0
180 50
11,3 го,о
20,0
20,0
20,0
10,0 в г
8,73
5,0
1О, О
13,0
5i85
2,73
6,70
2,73
4>39
1О,О
40,0
10,0
1О,О
20,0
630
25,0!
2,Î
25,0
15,0
20,0
15,0!
Oi 0
1О,О
15,0
10,0
365
20,0
20,0
5,0
20,0
20,0
5,0
5 0
1О,О
1О,О
5 0
25,0
25,0
18,0
20,0
15,0
0,89
13,0
5,0
2,0
2,0
2,0
4,0
3,0
40,0
40,0 зо,о
1О,О
10,0
20,0
10,0
5,0
1О,О
10i0
445
5,70
15,Î
20,0
20,0
25,0 зо,о
5,0
15,0
20,0
20,0 го,о
20,0
631
23,0 + 1,75 3,89
20,0
20,0
25,0
14,0
20,0
1,О О
2,0 + 1,99
1,О
1,0
1,0
1,О
1,О
667
4,47
1О,О Устойчивая линия, ФФ
Восприимчивый сорт.
Штамм 690-10 выращивают, как описано в примере 2. Культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием через бумажные фильтры, подкисляют до рН 4,0 2 н. раствором HCI, тщательно взбалтывают с этилацетатом, взятом в соотношении 1:5.
Смесь отстаивают, отделяют этилацетат в делительной воронке и испаряют. Полученный осадок растворяют в небольшом количестве воды, подщелачивают 1чаНСОз до рК
8 — 8,5. Препарат очищают, встряхивая дважды с половинным объемом эфира. Затем культуральную жидкость отделяют, снова подкисляют до рН 4,0, добавляют эфир в
5-кратном объеме и снова взбалтывают.
Эфир сливают с испарительные чашки. После испарения эфира образуется экстракт, содержащий фузариевую кислоту.
Эффективность штамма 690-10, Штамм 690 — 10 по патогенности превышает штамм 690 в 2 раза (интенсивность развития болезни по корневым гнилям 94,4 и 38,4%, по поражению семядолей 58,4 и
3,0 +3,9
15,0 5>83
19,02» 6,1
12,0+ 1,22
17,О + З,О
7)0 + 1)22
20,0+ 1,96
2,0+0,4
28,0+ 5,83
18,о+ г,гз
22,0 +2,54
19,0 +-2,23
1661206 лина гниения ко ня, мм
Устойчивая линия к-8409
Восприимчивый сорт
Бк ия
10,0
10,0
10,0
1 1,0
10,0
12,0
13,0
10,0
10,0
24,0
10,0
10.0
10,0
10,0
15,0
10,0
10,0
15,0
10,0
10,0
10,0
15,0
15,0
20,0
15,0
15,0
15.0
15.0
15,0
10,0
Номер клонов
2
4
6
8
11
12
13
14
16
1 7
18
19
21
22
23
24
26
27
28
29
25,0
25,0 .
22,0
23,0
25,0
25,0
25,0
23,0
22,0
30,0
25,0
15,0
20,0
20,0
25,0
10,0
10;0
15.0
15,0
25,0
10,0
25,0
25,0
29,0
25,0
16,0
25,0
26,0
22,0
15,0
Таблица 2
Таблица 3
1661206
Таблица 4
Лабо ато ная о енка
Полевой ин екционный он
Развитие болезни, Иммунологическая характеристика обаз ов
Иммунологическая характеристика обаз ов
Длина гниения корня, мм
1 — 10
0 — 25
26 — 50
51 — 75
11-20
21 — 30
31 и более
76 — 100
Составитель Т. Полянская
Техред М.Моргентал Корректор И. Муска
Редактор Н. Яцола
Заказ 2097 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101
Устойчивые
Средневосприимчивые
Восприимчивые
Сильновосприимчивые
В ысокоустойчивые, устойчивые
Средневосприимчивые
Восприимчивые
Сильновосприимчивые