Способ извлечения нуклеиновых кислот из водородокисляющих бактерий alcaligenes еuтrорнus z-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к прикладной биохимии и молекулярной биологии, в частности к способам получения нуклеиновых кислот. Целью изобретения является увеличение выхода нуклеиновых кислот, упрощение, ускорение и удешевление процедуры выделения. Отличительной чертой метода является сокращение числа стадий в процессе выделения - разрушение клеток, экстракция и депротеинизация проводятся одновременно. А именно, суспензию клеток бактерий ALCALIGENES EUTROPHUS Z = 1 обрабатывают смесью бензилового и изобутилового (20 - 30: 5 - 30% по объему) или бензилового спирта и хлороформа (30 - 40: 10 - 20% по объему), перемешивают, оставляют при комн. температуре на 40 мин - 4 ч, затем разбавляют в 3 - 10 раз 5%-ным NACL и 0,4%-ным NA-цитратом, центрифугируют и нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают эталоном. Выход препарата составляет 65 - 70%, содержание белков незначительно. Метод может быть использован в крупномасштабном производстве, кроме того, в практике лабораторных работ по биохимии и молекулярной биологии. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4672188/13 (22) 17.02.89 (46) 07.07;91. Бюл. N 25 (71) Институт биофизики СО АН СССР (72) И.Н.Трубачев и Л.Ю.Щитова (53) 661(088.8) (56) Marmur J., 1961, J, Moi, В!о1„ч,3, р. 208. (54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТИЗ ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ

БАКТЕРИЙ ALCALIGENES EIJTROPKUS 2-1 (57) Изобретение относится к прикладной биохимии и молекулярной биологии, в частности к способам получения нуклеиновых кислот. Целью изобретения является увеличение выхода нуклеиновых кислот, упрощение, ускорение и удешевление процедуры выделения. Отличительной чертой метода является сокращение числа стадий в проИзобретение относится к области прикладной биохимии и молекулярной биологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, Цель изобретения — упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Разрушение бактериальных клеток, депротеиниэация и экстракция конечного продукта осуществляется в одну стадию, .Суспензию биомассы 3-16% в расчете на сухой вес в растворе 5-6%-ного NaCI u

0,4 — 0,5%-ного Na-цитрата перемешивают с системами двух типов: бензиловый и изобутиловый спирты (конечная концентрация

20-40 и 5 — 30 об.% соответственно) или бензиловый спирт и хлороформ (конечная концентрация 20 — 40 и 10 — 20 об;%

„„Я3„„1661217 А1 (я)л С 12 P 19/34, С 07 Н 21/00 цессе выделения — разрушение клеток, экстракция и депротеинизация проводятся одновременно. А именно, суспенэию клеток бактерий Alcallgenes eutrophus 2-1 обрабатывают смесью бенэилового и изобутилового (20 — 30: 5 — 30% по обьему) или бензиловога спирта и хлороформа (30-40:

10 — 20% по объему), перемешивают, оставЛяют при комн. температуре на 40 мин — 4 ч, затем разбавляют в 3-10 раз 5%-ным NaCI и 0,4%-ным Na-цитратом,О центрифугируют и нуклеиновые кислоты иэ супернатанта осаждают этанолом. Выход препарата составляет 65 — 70%, содержание белков незначительно. Метод может быть использован в крупномасштабном производстве, кроме того, в практике лабораторных работ по биохимии и молекулярной биологии. 2 табл. (,Ь соответственно) в течение 40 — 360 мин до Q образования устойчивой эмульсии, из которой нуклеиновые кислоты экстрагируют раствором 5 — 6%-ного NaCI и 0,4M Na-цитрата.

Дебрис и денатурированные белки удаляют центрифугированием (10 мин, 4000 об/мин) 4 и нуклеиновые кислоты иэ супернатанта осаждают добавлением атанола (бб-70 в

o6.%) при 0 — 4 С, 4 ч. Все операции проводят при комнатной температуре.

Способ обеспечивает 65 — 70%-ный выход нуклеиновых кислот из клеток

AIcaligenes eutrophus Z-1, получаемые препараты практически свободны от примесей белка.

Пример 1. 3 r биомассы, содержащей

14,7% сухого вещества и 11,2% нуклеино1661217 вых кислот, перемешивают с 1,2 мл насыщенного раствора NaCI в 2,4 -ном цитрате . и с 4,2 мл воды, Получают 6 -ную (по сухому веществу) суспензию в 5 -ном NaCI и 0,4 ном цитрате Na, перемешивают с 2,1 мл бензилового и 1 мл изобутилового спиртов, что соответствует 20 и 10 об. .. Выдерживают эмульсию 120 мин, разбавляют в 10 раз

94 мл 5 -ного NaCI и 0.4 -ного цитрата Na, отделяют центрифугированием и отбрасывают осадок, Из раствора осаждают нуклеиновые кислоты двумя объемами этанола при 0 С, собирают осадок центрифугированием, 10 мин 4000 об/мин. Осадок содержит 39,6 мг нуклеиновых кислот, белка осадок не содержит. Выход нуклеиновых кислот 68, Пример 2, 3 r биомассы, содержащей

12,9 cyxorn вещества и 10,0 нуклеиновых кислот в расчете на сухой вес, смешивают с 1 мл насыщенного раствора NaCI в

2,4 -ном цитрате Na. 10 -ную суспензию биомассы смешивают с 2,4 мл бензилового спирта и 1,6 мл хлороформа, что соответствует 30 и 20 об. соответственно. Эмульсию выдерживают 180 мин при комнатной

-,емпературе, разбавляют в 10 раз 72 мл

5 / -ного NaCI и 0,4%-ного цитрата Ка, отделяют центрифугированием при 4000 об/мин 10 мин надосадочную жидкость и осаждают нуклеиновые кислоты двумя объемами этанола при 0 С. Осадок собирают центриффгированием при 0 С, 4000 об /мин. Осадок не содержит белка, содержит 27,1 мг нуклеиновых кислот, что соответствует

70 -ному выходу.

В табл. 1 и 2 приведены результаты получения нуклеиновых кислот.

Предлагаемый способ позволяет добиться более полного выхода нуклеиновых кислот из клеток Alcaligenes etrophus Z-1 (65 — 70 ) по сравнению с результатами выделения по известным способам (до 45 ).

Важным является и низкое содержание белковых примесей в получаемом препарате нуклеиновых кислот. Способ отличается от известных простотой и непродолжительностью, а также сокращением времени депро5 теинизации токсическими веществами (хлороформ, фенол). Кроме того, снижается себестоимость конечного продукта за счет использования доступных дешевых реактивов, 10 Предлагаемый способ может быть использован в крупномасштабном производстве нуклеиновых кислот — важном продукте, являющемся основой для получения ряда ценнейших фармакологических

15 препаратов. Кроме того, предлагаемый способ может найти применение s практике молекуля рнобиологических и биохимических исследований, 20 Формула изобретения

Способ извлечения нуклеиновых кислот из водородокисляющих бактерийА!саИцепеэ

eutrophus Z-1, предусматривающий лизис клеток, отделение раствора нуклеиновых

25 кислот от клеточного дебриса, его депротеинизацию и осаждение нуклеиновых кислот спиртом, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, лизис клеток с од30 новременной депротеинизацией проводят путем добавления 3 — 16 суспензии клеток в 5 — 6 -ном Na CI и 0,4-0,5 -ном цитрате Na смеси 20 — 30 об. бензилового спирта и

5 — 30 об. изобутилового спирта или смеси

35 30 — 40 об. бензилового спирта и 10 — 20 об. хлороформа, перемешивания, выдерживания при комнатной температуре 40240, мин разбавления эмульсии в 3 — IO раз смесью растворов 5-6 / NaCI и 0,4-0,5

40 Na-цитрата и отделения надосадочной жидкости от белков и клеточного дербиса, а осаждение нуклеиновых кислот проводят

65 — 70; по объему этанолом.

1661217

Таблица 1 ношение к, / нукновые лоты

0

0

0

0

С

0

42

01

Таблица 2