Способ получения кислого альфа-1-гликопротеина

Способ получения кислого альфа-1-гликопротеина

Реферат

 

Изобретение касается фракционирования сыворотки крови человека. Цель - повышение выхода и специфической активности кислого альфа-1- гликопротеина, при этом балластный осадок гомогенизируют в воде и растворяют в гидрооксиде натрия. Полученный раствор охлаждают до 3 - 15^oС и вносят в него этанол. После центрифугирования смеси надосадочную жидкость одновременно концентрируют и подвергают диафильтрации на полых волокнах.

Изобретение относится к медицине, к фракционированию сыворотки крови человека. Целью изобретения является повышение выхода и специфической активности целевого продукта, а также упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. Балластный осадок гомогенизируют в дистиллированной воде в течение 1 ч. Затем растворяют его в гидрооксиде натрия и перекачивают в реактор. Раствор охлаждают до температуры 3-5^оС, доводят рН до 4,7 и вводят в него этанол со скоростью 0,5 л/мин. Вновь коррегируют рН до 4,7, перемешивают в течение 1 ч и центрифугируют при температуре 3-15^оС. Осадок отделяют, а центрифугат концентрируют на ультрафильтрационной установке, состоящей из двух аппаратов (АР-2). Концентрат пропускают через ДЭАЭ-целлюлозу, отмывают буфером, затем 0,15М NaCl и элюат собирают. Затем концентрируют на аппарате разделительном АР-0,2. Продукт пропускают через КМ-целлюлозу и концентрируют на аппарате АР-0,2, проводят диафильтрацию, используя дистиллированную воду и получают чистый целевой продукт. П р и м е р. 6 кг осадка заливают 30 л дистиллированной воды и гомогенизируют 40 мин. Вводят 2 н.раствор NaOH до рН 8,7 в количестве 2,8 л. Раствор загружают в реактор и охлаждают до 3^оС, устанавливают рН 4,5 путем введения 4,2 л 1 н.раствора HCl. Затем вводят 96% этанола до концентрации 20% перемешивают в течение 1 ч и отделяют осадок центрифугированием при температуре 3^оС. Осадок в количестве 5,6 кг отбрасывают, а центрифугат в объеме 47 л концентрируют на ультрафильтрационной установке, состоящей из двух параллельно соединенных аппаратов разделительных АР-2 из полых волокон ВПУ-15 (г.Кириши), манометра и перистальтического насоса НШР-15 м. Площадь фильтрации составляет 4 м², при давлении 0,8-1,0 атм центрифугат концентрируют до 5 л в течение 1,5 ч. Далее концентрат подвергают диафильтрации, для чего продолжают процесс ультрафильтрации при непрерывном поступлении 0,025М ацетатного буфера с рН 3,7 (буфер N 1) из бутыли, расположенной на высоте 0,5-1 м от бутыли с продуктом. Расход буфера составляет 25 л, процесс диафильтрации занимает 0,8-1,0 ч. Концентрат в буфере N 1 в объеме 5 л пропускают через колонку с волокнистой ДЭАЭ-целлюлозой (г. Олайне). Регистрируют оптическую плотность элюата при длине волны 280 нм. Белки, несвязывающиеся с целлюлозой, отбрасывают и промывают колонку буфером N 1 до экстинции 0,01. Затем целлюлозу промывают 0,15М NaCl, приготовленным на буфере N 1, и собирают 4 л элюата, который содержит 75-80% кислого альфа 1-гликопротеида (КГП). Элюат подвергают концентрированию до 1 л и диафильтрации на аппарате разделительном АР-0,2, используя 6 л 0,01 М ацетатного буфера с рН 3,9 (буфер N 2). КГП в буфере N 2 пропускают через волокнистую КМ-целлюлозу (г.Олайне) и собирают 1,5 л чистого КГП, несвязывающегося с КМ-целлюлозой в данных условиях. Чистый КГП концентрируют до 0,5 л и диафильтруют, используя дистиллированную воду в объеме 3 л. Получают целевой продукт (0,5 л КГП с концентрацией 21 мг), который подвергают стериализующей фильтрации, разливают в ампулы, высушивают из замороженного состояния и герметизируют. Преимущества предлагаемого способа состоят в следующем. По сравнению с прототипом длительность получения целевого продукта сокращается на две стадии. По прототипу длительность процесса составляет 4 суток, а по заявляемому методу только 1 сутки. Выход целевого продукта увеличивается в 3,7 раза. Если по прототипу КГП от его содержания в исходной плазме составляет 10% то по заявляемому методу выход составляет 37% или 0,3 г с 1 л исходной плазмы. Биологическая активность целевого продукта, определенного по степени выживаемости изолированного кожного лоскута у мышей, увеличивалась на 30% В тесте летальной синегнойной инфекции выживаемость животных, обработанных препаратом, полученным по заявляемому способу возросла на 25% а выживаемость животных на седьмые сутки составила 85% против 60% в группе мышей, обработанных препаратом по прототипу. Общая продолжительность жизни животных увеличилась в 1,5 раза и составила 7,2 суток против 5,5 суток по прототипу.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОГО АЛЬФА-1-ГЛИКОПРОТЕИНА путем растворения, осаждения этанолом, центрифугирования, концентрирования надосадочной жидкости с последующим хроматографическим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и специфической активности целевого продукта, а также упрощения способа, осаждение этанолом производят при температуре 3 - 15^oС, а после центрифугирования надосадочную жидкость одновременно концентрируют и подвергают диафильтрации на полых волокнах.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 06.07.2002

Номер и год публикации бюллетеня: 19-2003

Извещение опубликовано: 10.07.2003