Способ получения антигенных детерминант vp @ -белка fmd вируса субтипа о @ к

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антигенных детерминант VP<SB POS="POST">I</SB>-белка FMD вируса. Способ получения антигенных детерминант вируса предполагает твердофазный синтез пептидов со следующей структурой [Цис-Цис(200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)]-Про-Цис-Гли, или [(200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли, или Н-Цис [Арг-Тир-АСп-Арг-Ала (141 - 158)-Лей-Про-Про-Тре [Глу-Ала (200 - 213)]-он.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л А 61 К 39/135

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4027624/13 (22) 31.05.86 (31) 740780 (32) 03,06.85 (33) US (46) 07.07.91, Бюл. М 25 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Ричард Дэннис Димарчи и Джеральд

Стивен Брук (US) (53) 661 (008.8) (56) ЕР М 0090581, кл. А 61 К 39/135, 1983.

Chemical Abstracts, 1983, v. 99, 13. Sep.

26, р. 442.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антигенных детерминант ЧР белка вируса ящура.

Заболевание ящуром является высокоинфекционным, приводящим к обессиливанию заболеванием, которое вызывается вирусом ящура, представляющего собой вирус животных семейства пикорнави русов.

Способ получения антигенных детерминант вируса ящура предполагает твердофазный синтез пептидов ((Цис-Цис (200 — 213)-Про-Про-Сер (1 41-158)Про-Цис-Гли или ((200 — 213)-Про-Про-Сер (141 — 158))-ПроЦис-Гли, или Н-Цис(Арг-Тир-Асп-Арг-АспАла (141-158)-Лей-Про-Про-Тре(Глу-Ала (200 — 213))-он.

П ример1.

I, Получение синтетических вакцин против ЭНР, Все пептиды синтезируют с помощью твердофазного пептидного

„„5LI„„1662338 А3 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННЫХ

ДЕТЕРМИНАНТ ЧР -БЕЛКА FMD ВИРУСА

СУБТИПА 01К (57) Изобретение относится к биотехноло. гии и может быть использовано для получения антигенных детерминант VPt-белка FMD вируса, Способ получения антигенныхдетерминант вируса предполагает твердофазный синтез пептидов со следующей структурой: (Цис-Цис (200-213)-Про-П ро-Сер (141 — 158))Про-Цис-Гли, или ((200 — 213)-Про-Про-Сер (141 — 158)-Про-Цис-Гли, или Н-Цис (Арг-ТирАсп-Арг-Ал а (141-158)-Л ей-П ро-П ро-Тре (Глу-Ала (20 — 213))-он. синтезатора с использованием полуавтоматического программирования. Все реагенты во всех случаях, за исключением специально оговоренных, являются технически доступными продуктами высшего качества. В качестве дихлорметана применяют продукт С (СН2С!2) для жидкостной хроматографии с СЬ высокой разрешающей способностью. Диизопропилэтиламин (ДИЭА) перед использо- (Д ванием перегоняют из нингидрина, . (Ъ

Получают сополимерную смолу (1 «(» стирола р и 1 дивинилбензола) в виде шариков с размерами 0,076 — 0.038 мм.

Качество защищенных аминокислот оценивают тонкослойной жидкостной хро- G3 матографией по углу оптического вращения аминокислотным анализом и масс-спектрографическим анализом.

А. Получение аминометиловой смолы. К

100 г тщательно промытой смолы в трехгорлой круглодонной колбе добавляют 16 r (81

1662338 ммоль) N-(оксиметил)фталимида и 2 л смеси трифторуксусной кислоты с хлористым метиленом в обьемном соотношении 1;1, При интенсивном перемешивании верхнего слоя осторожно добавляют 40 мл (0,44 моль) трифторметансульфокислоты. По истечении

6 ч реакции при 22 С раствор профильтровывают и подвергают обильной промывке смесью трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в объемном соотношении 1;1, метиленхлоридом, этанолом и наконец вновь метиленхлоридам. Сушат в вакууме, смолу кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч в 2 л этанола, содержавшего

5% гидразина, отфильтровывают в теплом состоянии и промывают 4 порции по 2 л кипящего этанола, 4 порциями по 2 л метанола и 4 порциями по 2 л метиленхлорида, Полученный продукт высушивают в вакууме, Он характеризуется аминовой функциональной активностью 0,836 ммоль/г, В, Получение бок-глицин-(4-(оксиметилфенил)}-уксусной кислоты. Проводят синтез бок-глицин-(4-(оксиметилфенил))-уксусной кислоты.

С. Присоединение полученного глицина к аминометиловой смоле, 1,4 MMQRb бок-гли(4-(оксиметилфенил))-уксусной кислоты растворяют в 20 мл смеси диметилформамида с хлористым метиленом в объемном соотношении 1,3 при 0 С в присутствии 1,4 ммоль

1-оксибензотризола (ОБТ). Затем добавляют эквивалентное количество (1,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и реакционную смесь перемешивают в течение

10 мин при О С, после чего дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием и верхний слой добавляют, к 4 г аминометиловой смолы, суспендируют в 20 мл метиленхлорида, По истечении 2 ч смолу отфильтровывают, трижды промывают с использованием

40 мл метиленхлорида, а затем суспендируют в 40 мл смеси 0,5н, уксусного ангидрида с 0,1 M ДИЭА и метиленхлоридом, По истечении еще 2 ч смола становится нингидринотрицательной, Далее смолу трижды промывают 40 мл метиленхлорида, после чего трет-бутилоксикарбонильную защитную группу удаляют в 40 мл смеси трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в обьемном соотношении 1:1.

D. Протокол повторяющегося постадийного синтеза. В каждом случае используют двойное сочетание каждой аминокислоты в трехкратном избытке амина, Хотя Лсп, Гли и Арг подвергнуты двукратному сочетанию в виде их предварительно полученных ОБТэфиров, остальные аминокислоты вначале подвергают сочетанию в виде их предварительно полученных ангидридов и повторяют в виде их предварительно полученных ОБТэфиров. Нейтрализацию, удаление защитных групп и весь процесс промывки проводят полностью автоматически в соот5 ветствии с нижеследующим протоколом в

15 мл растворителя на 1 г исходной смолы, Смесь 5% ДИЭА (дихлорметан)

Смесь 5% ДИЭА (дихлорметан)

Первое сочетание

Первое сочетание (дихл ар метан)

Смесь 5% ДИЭА (дихлорметан)

Смесь 5% ДИЭА (дихл ар метан)

Второе сочетание

Второе сочетание (дихлорметан)

Смесь 50% ТФК (дихлорметан) (2 х2 мин).

10 (6 х 1 мин). (1 х 120 мин). (6 х 1 мин). (2 х 2 мин)..

15 (6 х 1 мин), (1 х 120 мин) 20 (6 х 1 мин). (1 х2 мин, 1 х 20 мин).

Смесь 50% ТФК (дихлорметан) 25 (6 х 1 мин).

В процессе синтеза для получения укороченных иммуногенов удаляют аликвоты

30 смолы, Е, Получение 01К, VPI (141-158)-ПроЦис-Гли-пептид с 21 остатком.

Приблизительно 3 г пептидиловой смолы, содержащей 1,34 r защищенного OIK, 35 VPI (141-158)-Про-Цис-Гли, обрабатывают

30 мл смеси фтористого водорода с и-крезолом в соотношении 9:1 при температуреО C в течение 60 мин. После завершения реакции отщепления смолу выпаривают досуха

40 в вакууме при О С, после чего промывают 5 порциями по 50 мл диэтилового эфира. Освобожденный от защитных групп пептид растворяют с последовательными обработками уксусной кислотой: 10%-ная уксусная

45 кислота (3 порции по 30 мл), 50%-ная уксусная кислота (1 порция 30 мл) и 10%-ная уксусная кислота (3 порции по 30 мл). Пеп. тид сушат вымораживан IBM с 76-ным выходом, Титрование по Эллману показывает, 50 что минимальное содержание свободных сульфогидрильных групп составляет 70%.

Этот пептид чистят с использованием гельпроникающей хромотографии на смоле Сефадекс G — 25 в 10%-ной уксусной кислоте, 55 после чего подвергают дитиотреитоловому (ДТТ) восстановлению, получая исключительно гомогенную мономерную фракцию, как это устанавливают жидкостным хроматографическим анализом с высокой разрешающей способностью.

1662338

30

F. Получение О К, VPi (Лей-Про-Про-Сер (141 — 158))-Про-Цис-Гли (пептид с 25 остатками).

Приблизительно 1,1 г пептидиловой смолы, которая содержит 0,532 r защищенного О К, VPi (Лей-Про-Про-Сер (141-158))Про-Цис-Гли, обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают с 84%-ным выходом целевой пептид.

G, Получение OiK, VPi (200 — 213)-ПроПро-Сер ((141 — 158)) — (пептид с 38 остатками).

Приблизительно 2,4 г пептидиловой смолы, содержащей 1,29 г защищенного

О К, ЧР ((200 — 213)-Про-Про-Сер (141 — 158))Про-Цис-Гли, обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего с

97%-ным выходом получают целевой пептид.

H. Получение О К, VPi (Цис-Цис (200—

213)-Про-Про-Сер (141 — 158))-Про-Цис-Гли (пептид с 40 остатками).

Приблизительно 2,5 г пептидиловой . смолы, которая содержит 1,39 r защищенного OiK, VPi (Цис-Цис (200 — 213)-Про-Про-Сер (141 — 158)-Про-Цис-Гли обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего целевой пептид получают с 97%-ным выходом.

Получение OiK, ЧР Н-Цис-(Arp-Тир-АспАрг-Асп-Ала (141 — 158))-Лей-Про-Про-Тре (Глу-Ала (200 — 213))-он-пептид с 45 остаткаЗащищенную О К VPi Н-Цис -(Арг-ТирAcn-Apr-Acn Ana-(141 — 158)-Лей-Про-Про-Тре (Глу-Ала (200 — 213))-пептидиловую смолу обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают пептид, указанный в заготовке данной части примера.

Пример 2. Химическое присоединение пептидов к KLH через СПДП.

Максимально целесообразный уровень нагрузки KLH N-сукцинимидил-3-(2-пиридитно)-пропинатом (СПДП) определяют в соответствии со степенью осаждения комплекса, которая достигается в течение 60 мин реакции. Устанавливают, что 250-молярный избыток СПДП в соотношении KLH являлся оптимальным, 0,5 г KLH (примерно 1 х-10 ммоль) растворяют в 25 мл 0,1 М раствора вторичного фосфата натрия (рН 7,2) при осторожной обработке ультразвуком, Небольшое количество нерастворимого материала удаляют центрифугированием и в верхний слой добавляют 7,81 мг СПДП (2,5 х 10 ммоль) в 625 мкл ДМФ. После прекращения поглощения щелочи образец центрифугируют и обессоливают верхний слой на Сефадексе G-25 в 0,1 M растворе вторичного фосфата натрия при рН 7,2 и скорости 20 см/ч.

Устанавливают, что уровень нагрузки, достигнутый в процессе образования производного, составляет приблизительно 40% по ДТТ-восстановлению.

К 100 мг функционалиэованного К Н (2 х 10 лиганда) в 25 мл 0,1 M раствора вторичного фосфата натрия (pH 7,2) добавляют десятикратный избыток (44 мг) (141 — 158)Про-Цис-Гли восстановленного пептида в

600 мкл 0,1 М триметилоламинометила (рН 7,4). За ходом реакции следят по высвобс;кдению лиганда, которое практически количественно завершается втечение 60мин при 22 С, Образец обессоливают на смоле

Сефакрил S-200 в 0,1 M растворе бикарбоната аммония (рН 7 5) и лиофилизируют. Выход пептидов с 21, 25 и 38 остатками в пересчете на лимитированный реагент составляет, соответственно, 84, 85 и 68%.

Приготовление композиций на основе пептидов.

Все пептиды и продукты сопряжения пептид-К Н растворяют в 10 мкМ триметилоаминометана (рН 8,0) до желаемой концентрации, после чего разбавляют в соотношении 1:1 комплектной вспомогательной добавкой Фрейнда. Общий объем, а также концентрация антигена, вводимого каждому животному, описаны для каждого эксперимента.

II. Биологический протокол, А. Вакцинация морских свинок. В ходе проведения всех экспериментов используют самок морских свинок весом 450 — 500 г. Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке подкожной инъекцией.в объеме по 0,15 мл на каждого члена группы морских свинок из пяти животных.

Единственным исключением относительно указанного общего обьема дозы 0,15 мл является доза объемом 0,45 мл, которую используют при антигенном доэировочном титровании для достижения наивысшей установленной концентрации, Контрольную вакцину готовят с использованием штамма

Oi Kanfbenren, являющегося единственным, bio которому были опубликованы данные о последовательности. Вакцину готовят с использованием алюминия гидроокисного геля, причем она содержит 1,66 мг сапонина на каждую дозу, Каждой из пяти морских сВМНоК вводят подкожной инъекцией по 1 мл вакцины. В качестве вирусного возбудителя, как указано выше, используют штамм Qi

Kanfbenren, В процессе вирусного титрования проводят разбавление 1/20 с целью получить дозу заражения инфекционных

3000 доз на каждое животное. Всех под1662338

Составитель T. Забойкина

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О. Кравцова

Редактор В, Данко

Заказ 2138 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101 опытных животных заражают вирусом подкожным введением в подушечку левой задней лапы в объеме 0,02 мл. Каждую зараженную морскую свинку наблюдают в течение последующих 7 дн, следя за развитием вторичных или общих поражений другой задней ноги или передних ног и рта.

Критерием защиты служит отсутствие каких-либо вторичных поражений.

В. Вакци нация крупного рогатого скота.

Для всех .экспериментов используют телок в возрасте от 6 до 8 мес, весивших приблизительно по 150 — 180 кг, смешанного разведения, которые характеризуются восприимчивостью к заболеванию ног и рта.

Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке путем подкожной иньекции в объеме по 3 мл каждому члену группы иэ трех животных, В каждом эксперименте группу из трех животных не подвергают вакцинации (контрольные животные). Всех животных заражают подкожным введением в язык 10 0щ све4 жетитрованных вирусов OIBFS в объеме дозы 0,1 мл в десяти точках языка, После заражения животных ежедневно осматриваютдля выявления повышения температуры тела и развития поражения языка и ног, Животные считаются защищенными от заболевания при отсутствии развития каких-либо вторичных поражений по истечении семи дней после их заражения.

С. Определение титров нейтрализации сыворотки (THC), Для количественной оценки титров нейтрализации сыворотки титры антител ELfSA определяют как направленные против пептида 140 — 160, Во всех вакцинациях с использованием описанных пептидов достигнута крайне тесная взаимосвязь между результатами определений

ELjSA и титрами нейтрализации сыворотки, III, Биологические результаты.

Наиболее убедительным методом определения относительной потенции ряда синтетических пептидных вакцин является метод определения их минимальной за5 щитной молярной дозировки, Анализ показывает заметное улучшение титров нейтрализации сыворотки и защиты для пептидов с 38 и 40 остатками в сравнении с аналогичными результатами, которые до10 стигаются при использовании пептида с 21 о статком, Пептиды с 38 и 40 остатками являются эквивалентными, если о них судить в пределах погрешности эксперимента, вследствие

15 чего сводится к минимуму значение аминокислотных концевых цис-цис-остатков в молекулах последних, Оба эти пептида обеспечивают, по-видимому, полную защиту в дозировке. которая составляет менее

20 0,1 — 0,001 дозировки антигенного пептида с

21 остатком, При молярной дозировке, сопоставимой с той, которая обеспечивает защиту посредством пептида с 21 остатком в

25 комплектной вспомогательной добавке

Фрейнда, пептид с 40 остатками обеспечивает полную защиту с комплектной технически доступной добавкой гидрата окиси алюминия. Абсолютный вес антигена, обес30 печивающего полную защиту морских свинок с использованием этой последней вспомогательной добавки при однократной вакцинации, составляет менее 1 мг.

35 Формула изобретения

Способ получения антигенных детерминант VPI-белка FMD вируса субтипа О К, включающий твердофазный синтез пептидов, о тл и ч а ю шийся тем, что осуществляют синтез

40 пептидов (Цис-Цис (200-213)-Про-Про-Сер (141 — 158))-Про-Цис-Гли, или ((200 — 213)-ПроПро-Сер (141 — 158))-Про-Цис-Гли, или Н-Цис (Арг-Тир-Асп-Арг-Асп-Ала (141-158))-ЛейП ро-П ро-Тре (Глу-Ала (200-213))-он,