Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов

Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНК-белок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки. Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа. В основе метода лежит количественное определение УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок в присутствии и отсутствии исследуемых веществ посредством диссоциации раствором 1,5 М NACL в 1% ДДС, разделения на ДНК и ДНК-белковый комплекс центрифугированием на холоду и регистрации спектра гельфильтрации раствора облученного ДНП через колонку с полиакриламидным гелем АСА-54. Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок (N) используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (S<SB POS="POST">к</SB>) и после УФ-облучения (S<SB POS="POST">уф</SB>) по формуле (S<SB POS="POST">к</SB> - S<SB POS="POST">уф</SB>) / S<SB POS="POST">к</SB> <SP POS="POST">.</SP> 100% = N. Эффективность действия химического соединения может быть охарактеризована двумя способами: по расчетной величине N, а также по кинетической оценке выхода сшивок от дозы облучения - константе K, определяемой как тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости N от дозы облучения. 1 табл.

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

6ЙЖ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4424607/13 (22) 13.05,88 (46) 23.07.91. Бюл. N 27 (71) Всесоюзный заочный политехнический институт (72) B.М. Жильцова, Е.М. Миль и Г.Я. Коломийцева (53) 577.21 (088.8) (56) Analyt. Biochem, 1985, ч. 149, р. 575-581. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СШИВОК

ДНК-БЕЛОК, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ХРОМАТИНЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ (57) Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНКбелок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки. Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа, В основе

Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНКбелок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки.

Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа.

Способ заключается в том, что используют УФ-облученный биополимер ДНП.

Облучение растворов ДНП УФ-светом.приводит к специфической реакции — образованию сшивок ДНК-белок в местах контактов. Ж „1664844 А1

УФ-индицированных сшивок ДНК-белок в присутствии и отсутствии исследуемых веществ посредством диссоциации раствором

1,5 M NaCI в 1% ДДС, разделения на ДНК и

ДН К-белковый комплекс центрифугированием на холоду и регистрации спектра гельфильтрации раствора облученного ДНП через колонку с полиакриламидным гелем

АСА-54. Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок (n) используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле ($,) и после УФ-облучения (Syg) по формуле (Як-Буф)/5, х 100% = n. Эффективность действия химического соединения может быть охарактеризована двумя способами: по расчетной величине и, а также по кинетической оценке выхода сшивок от дозы облучения — константе К, определяемой как тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости п от дозы облучения.

1 табл.

ДНК и гистонов, что.сопровождается увеличением количества нерастворимого в 1%ном растворе додецилсульфата натрия и 1,5

М хлориде натрия ДНК-белкового комплекса. и уменьшением количества свободной

ДНК. Данное обстоятельство используется для определения степени сшивания ДНКбелок и диссоциации свободной ДНК из

ДНП в зависимости от дозы облучения в присутствии испытуемых химических соединений, В основе метода. лежит количественное определение УФ-индуцированных сшивок

ДНК-белок в присутствии и отсутствии исс1664844 ледуемых веществ посредством регистрации спектра гельфиль1рации раствора ДНП через колонку с полиаvðèламидным гелем

A CA-54.

Для количественной оценки выхода 5 сшивок ДНК-белок используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (S») и при УФ-облучении (Sy4,) после прохождения колонки с ACA-54 по формуле (S» пуф)/S» 100 = и. 10

Пример, Препараты ДНП выделяют из свежей печени крыс. Для извлечения ядер печень гомогенизируют в растворе 0,1

M хлорида натрия и центрифугируют при

4000 o6/мин в течение 10 мин. Надосадоч- 15 ную жидкость сливают, осадок вновь гомогенизируют в 10-кратном объеме раствора

0,14 M КаС1 с последующим центрифугированием взвеси при 4000 об/мин в течение

15 мин, Операцию промывания осадка про- 20 водят 5-6 раэ с целью удаления липидов и растворимых белков, Для извлечения ДНП полученный осадок ядер подвергают гемолизу в дистиллированной воде (рН 6) и оставляют на холоду 25 в течение 30 мин. Первый гемолизат сливают, а промытый осадок вновь заливают дистиллированной водой и оставляют на мешалке (3000 об/мин) на холоду в течение 12 ч. 30

Полученный гелеобразный ДНП осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 18000 об/мин, Все операции по получению ДНП осуществляют при 4 — 6 С. 35

Полученный препарат характеризуют по количественному соотношению ДНК: белок методом Лоури. Содержание белка в препаратах ДНП составляет 50%.

Образцы ДНП в трис-буфере 0,05 М, рН 40

7,4 с исходной оптической плотностью при

260 нм, равной 1, тщательно смешивают с растворами препарата СД-б различной концентрации в той >ке буферной системе и подвергают облучению разными дозами 45

УФ-света с А 254 .нм при температуре

22,5 С. Мощность лампы 5,7 10 кБ/мм с.

13 2.

Для отделения сшитого облучения комплекса ДН К-белок к 1 мл облученного в присутствии препарата СД-6 ДНП добавляют 50

0,15 мл 1 -ного раствора додецилсульфата натрия (ДДС) и 0,4 мл 5М Na CI, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и 2 ч при 4ОС, а затем подвергают центрифугированию на холоду в течение 30 мин 55 при 8000 об/мин, Надосадочную жидкость отлеляю- и анализируют методом гельфильтрации через колонку размером 5х60 мм с полиакриламидным гелем, На колонку наносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 М трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадей пиков хроматограммы S»" и Зуф"Р (в контрсле и после облучения соответственно) находят количество сшивок ДНК-белок в присутствии СД-б. Оно составляет 32 для концентрации СД-6 10 М при дозе УФ-све-5 та 4,8 10 Дж/м, Величина константы К, 2 найденная для этой же концентрации препарата, составляет 3,0 10 2. Контроль.

К 1 мл образца ДНП в трис-буфере 0,05

М, рН 7,4 с исходной оптической плотностью при 260 нм, равной 1, добавляют 0,15 мл буфера и подвергают облучению разными дозами УФ-света с Л 254 нм при

22,5 С.

Для отделения сшитого комплекса ДНКбелок к 1 мл облученного раствора ДНП добавляют 0,15 мл 1%-ного раствора ДДС и

0,4 мл 5М NaCI, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и 2 ч при 4 С, а затем центрифугируют на холоду в течение

30 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отделяют и анализируют методом гельфильтрации через колонку. На колонку наносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 M трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадей пиков 1 Sp — необлученного ДНП и Яуф"— облученного разными дозами УФ-света контрольного раствора ДНП (без препарата) находят количество сшитого облучением комплекса ДНК-белок (n) и константу К, которые составляют соответственно 55 и1,.10

По предлагаемой методике изучают влияние на выход УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок ряда соединений: СД-30, парабензохинона, гидрохинона, цистеина и

Ар

В таблице приведены значения и и Kдля исследованных соединений в интервале наиболее эффективных концентраций 10

10 М, Как видно, наблюдается корреляция изменения значений и и К для исследованных веществ и эффективность их действия в равной степени может быть определена каждым из предложенных параметров, а величина константы позволяет оценить степень защитного или сенсибилизирующего действия препарата по отношению к образованию сшивок.

Предлагаемый способ используют в качестве тест-объекта УФ-облученный ДНП, который биологическим аналогом хроматина клетки, подвергнутого действиям экологического облучения. Известна функция

1664844

Составитель Н,Кузенкова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Кучерявая

Редактор Н.Рогулич

Заказ 2366 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

ДНП как носителя наследственной информации клетки, накоплено значительное количество данных, показывающих,.что

ДНК-белковые сшивки являются важной компонентой УФ-повреждений в клетке. 5

Например, обнаружены ДНК-протеиновые сшивки в нормальных фибробластях кожи, облученных солнечным светом. Поэтому весьма важной является задача выявления веществ-протекторов ДНК-белковых сши- 10 вок.

Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность в фотохемотерапии различных патологий химических агентов, вызывающих избира- 15 тельные сшивки-ДНК-белок. В связи с этим

УФ-облученный ДНП может быть использован для скрининга биологических препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки и обладающих 20 как протекторными, так и сенсибилизирующими действиями по отношению к образованию сшивок ДНК-белок.

Преимуществом способа является также быстрота и доступность получения рас- 25 творимого хроматина; Использование хроматографического метода анализа УФ.облученного препаратов ДНП позволяет с большой точностью при простоте и непродолжительности анализа получать надежную информацию о количестве сшивок

ДНК-белок. Кроме того, предлагаемый способ анализа биологической активности физико-химических соединений по сшивкам

ДНК-белок дает возможность работать с микроколичествами исследуемых веществ.

Формула изобретения

Способ определения сшивок ДНК-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов, предусматривающий диссоциацию ДНКбелкового комплекса, разделение ДНК-белкового комплекса на свободную ДН К и ДНК, связанную с белком,с последующим анализом сшивок ДНК-белок по количеству несвязанной ДНК, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения способа, диссоциацию осуществляют раствором 1,5 M NaCl 17; ДДС, разделение на свободную ДНК и ДНК-белковый комплекс проводят центрифугированием на холоду, а количество несвязанной

ДНК определяют на колонке, заполненной акриламидной агарозой.