Способ получения пептидов

Способ получения пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к способу получения пептидов, особенно Z-ALA-ALA-LEN-P-нитроанилида и Z-L-ASP-L-PHEOME (аспартама) в присутствии металлопротеиназ. Цель изобретения - повышение выхода трипептидов (Z-аспартама). Способ заключается в связывании Z-ALA-ALA с LEN-P-нитроанилидом и Z-L-ASP с L-PHEOME-HCL в присутствии протеиназы из BACILLUS CEREUS ZIMET 10700. МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ ИСПОЛЬЗУЮТ В ВИДЕ ФИЛЬТРАТА КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ИЛИ ОЧИЩЕННОГО АФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С БАЦИТРАЦИН-СИЛОХРОМОМ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!25 С l2 P 21/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (89) DD 257174 (48) 08.06.88 (21) 7774327/13 (22) 03.11.86 (31) WPC 12 P/284889 (32) 20.12.85 (33) 00 (46) 23.07.91. Бюл. М 27 (71) Научный центр по биотехнологии (00), Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(50) (72) Ульрих Корн (DD), А.Л. Остерман, В.М. Степанов, Т.Л, Воюшина, Л.А, Люблинская (SU), Райнер Грунов (DD) (53) 668.392 (088.8) Изобретение относится к способу по получению пептидов, особенно Z-Ala-AlaLeu-p-нитроанилида и Z-L-Asp-L-PheoMe (аспартама), в присутствии металлопротеиназ.

Из обзора ISOWA, V, Vuki Casei Kagaku

Kycka aishi, 36, 1978, 195-20 известен способ получения пептидов с использованием и ротеиназ в качестве катализаторов.

При этом используются серинпротеиназы и металлопротеиназы разного биологического происхождения из

Васillus ро!уmуха, Васiilus suЬtiiis, Bacillus thermoproteolyticus и др.

Недостатком данного способа является то. что эти ферменты требуют глубокой очистки, Из описания патента ФРГ N 3203292, кл, С 12 P 21/00, опублик 1985 известен способ получения пептидов путем связывания Z-Ala-Ala c Leu-p-нитроанилидом и Z-1.Б0 1664845 А1 (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения пептидов, особенно Z-Ala-А!а-Leu-рнитроанилида и Z-1 -Asp-L-Phe ОЫе (аспартама) в присутствии металлопротеиназ. Цель изобретения — повышение выхода трипептидов (Z-аспартама), Способ заключается в связывании Z-Ala-Ala c Leu-p-нитроанилидом и Z-1 -Asp с 1 -PheOMe-HCI в присутствии протеинаэы из Bacillus cereus

ZIMET 10700. Металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного афинной хроматографией с бацитрацин-силохромом.

1 з,п.ф-лы, Asp c Zthe-оме-HCI в присутствии металлопротеиназы.

Недостатком этого способа является то, что при этом образуется незначительное количество трипептидов.

Целью изобретения является повышение выхода целевых продуктов.

Металлопротеинаэа из В.cereus ZIMET

10700 применяется для получения пептида

Z-Ala-Ala-Leu-р-нитроанилида или пептида

Z-L-Asp-L-PheOMe, при этом установлено, что этот фермент можно испольэовать также в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенного аффинной хроматографией с бацитрацин-силохромом.

Эффективность синтеза выше, если применяется очищенный фермент. Действенным методом очистки для металлопротеинаэы иэ Вас, cereus ZIMET 10700 является аффинная хроматография с бацитрацин-силохромом. В результате очистки получают

1664845

Формула изобретения

1, Способ получения пептидов Z-Ala-AlaLeu-p-нитроанилида или Z-L-Asp-PheOMe путем связывания Z-Ala-Ala c Leu-р-нитроанилидом или соответственно Z-L-Asp с L-PheOMe-HCi в присутствии металлопротеиназы из Bacillus cereus, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода целевых продуктов, используют металлопротеиназу из Bacillus cereus ZIMET

10700.

2, Способ поп1,отлича ющийся тем, что, металлопротеиназу используют в виде фильтрата культуральной жидкости или очищенную афинной хроматографией с бацитрацин-силох ромом.

Составитель А.Ульянова

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М.Кучерявая

Редактор Н.Рогулич

Заказ 2366 Тираж 362 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 фермент, почти свободный от углеводов и чужих протеинов. Этот фермент позволяет повысить скорость реакции и выход конечного продукта.

П ример 1,74мгZ-А!а-Ala è62ìã

Leu-р-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 500 мкл

5О мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мм Са-ацетата, при 35 С и добавляют 180 мкл фильтрата культуральной жидкости из Вас. cereus

ZIMET 10700, содержащего 140 мкг фермента. Концентрация субстратов при этом составляет по 200 мкмоль, При перемешивании в течение 25 ч при 35 С получено

51 продукта, Качественный анализ конечного продукта проводят тонкослойной хроматографией на силикагельных пластинках в системе н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода в соотношении 10:15:3:12, а детектирование в ультрафиолетовом свете после обработки нингидрином. и с помощью KJ после хлорирования, Кроме этого, для качественного и количественного определения конечного продукта применяют HPLC. Детектирование проводят у абсорбционного максимума р-нитроанилина (315 нм) после отделения субстрата от продукта в C s-колонке в ацетонитрильном градиенте, Дополнительно определяют выход

Z-Ala-Aia-Leu-р-нитроанилида гравиметрическим методом после повторной промывки

NaHCO и водой, Пример 2. 74 мг 2 .-А!а-Ala и 62 мг

Ieu-р-нитроанилида растворяют в 250 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл

50 мМ трис-НО, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата.

Общий объем составляет 900 мкл, а концентрация субстратов по 250 мкмоль, После чего доводят температуру до 35 С, добавляо ют 10 мкг фермента из Вас, cereus ZIMET

10700, очищенного аффинной хроматографией, и перемешивают 18ч при 35 С. Выход

Z-Ala-Ala-Leu-p-нитроанилида составляет

72%

Пример 3, 24,4 мг Z-Asp расТворяют в 30 мкл 6 í. NaOH и 42,2 мг PheOMe-HCI, растворяют в 200 мкл диметилформамида и смешивают с 300 мкл 50 мМ трис-НС1, рН

7,5, с 1 мМ Са-ацетата. После нагрева до

35 С добавляют 100 мкл фильтрата культуральной жидкости, содержащего 110 мкг фермента. После перемешивания в течение

24 ч выход составляет 387;, Качественное и количественное определение Z-аспартама соответствует методу примера 1, причем детектирование разделенного HPLC продукта проводят у 220 нм.

Пример 4, 122 мг Z Asp растворяют в 160 мкл 6 í. NaOH и 211 мг PheOMe-HCI в

800 мкл 50 MM трис-HCI, рН 75, с 1 мМ

Са-ацетата, После нагрева до 35 С добавляют 1 Ml фермента, очищенного аффинной хроматографией, в 100 мкл 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, с 1 мМ Са-ацетата, В результате перемешивания в течение 24 ч получают выход Z-аспартама 54 .

Пример 5, Способ осуществляют как в примере 4, причем четвертное количество реактандов растворяют в 2,5 мл 50 мМ трисkCI-ном буфере, рН 7,0, с 1,0 мМ Са-ацетата. После повышения температуры до 35 С добавляют 3 мг фермента, очищенного аффинной хроматографией. Через 5 ч перемешивания твердый осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость снова инкубируют. Образующийся в течение следующих 5 ч осадок опять центрифугируют и определяют количество Z-аспартама. Общий выход составляет 85 .