Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе

Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе относится к области медицины, в частности к судебно-медицинской экспертизе для определения степени опьянения и диагностики предрасположенности к алкоголизму. С целью повышения чувствительности и точности способа при работе с биологическим материалом его предварительно подвергают микроперегонке, пробу вносят в раствор, содержащий НАД, алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, иоднитротетразолий фиолетовый с последующим спектрофотометрированием. При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через указанный раствор. Использование изобретения позволяет повысить чувствительность определения этанола до 10 - 12 раз. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (зппп G 01 N 33/98

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4658456/14 (22) 29.01.89 (46) 30.07.91. Бюл. М 28 (71) Институт биологии Якутского филиала

СО АН СССР (72) В.В, Рогожин, Б. М. Кершенгольц, Т. П. Го орова, В. В. Тарасов и Х. Х. Турнин (53) 612.015(088.8) (56) Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии.— M.: Высшая школа, 1980, с, 179 — 181. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭТАНОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕРИАЛЕ И ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ (57) Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе относится к области

Изобретение относится к медицине, а именно к способам судебно-медицинской экспертизы, диагностики предрасположенности к алкоголизму, и может быть использовано наркологической службой, Цель изобретения — повышение чувствительности и точности определения этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе.

Способ осуществляют следующим образом.

Биологический материал предварительно подвергают микроперегонке, В раствор, содержащий 0,1 М, рН 10, глицин/NaOH-буфер, водный раствор НАД (24 мг/мл) и иоднитротетразолий фиолетовый, вносят перегнанную пробу и раствор алкогольдегидрогеназы (активность фермента составляет около 24 МЕ) из семян пшеницы с,„„ Ы„, 1666956 А1 медицины, в частности к судебно-медицинской экспертизе для определения степени опьянения и диагностики предрасположенности к алкоголизму. С целью повышения чувствительности и точности способа при работе с биологическим материалом его предварительно подвергают микроперегонке, пробу вносят в раствор, содержащий

НАД, алкогольдегидрогенаэу из семян пшеницы, иоднитротетразолий фиолетовый с последующим спектрофотометрированием.

При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через указанный раствор, Использование изобретения позволяет повысить чувствительность определения этанола до 10 — 12 раз, 2 з. и. ф-лы, 2 табл. последующим фотометрированием при длине волны 510 нМ.

При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через раствор, содержащий 0,1 М глицин/NaOHбуфер, рН 10, алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, НАД, Затем вводят иоднитротетразолий фиолетовый. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 М соляной кислотой и производят фотометрирование . при той же длине волны.

Пример 1. Определение этанола в сыворотке крови.

Предварительно путем микроперегонки отделяют этанол от сыворотки. Для этого 3 мл сыворотки помещают в пенициллиновый флакон. Туда же помещают стеклянные или пластмассовые открытые капсулы, объемом

0.8 — 1 мл, так чтобы верхний слой капсулы был ча 4 — 5 мл выше уровня сыворотки во

1666956 флаконе. В капсулы опускают наконечники охлаждающей системы. Нагревают флаконы на водяной бане при 80 С в течение 1 ч, Пары летучих жидкостей, включая этанол, конденсируются на охлаждающих наконечниках микроперегонки и стекают в капсулу, объем конденсата в капсуле достигает 0,30,5 мл. При этом достигается отделение этанола от белков и многих других веществ сыворотки крови, а также era концентрирование. Измеряют точный объем собранного конденсата в капсуле. Подготовленная проба может храниться в закрытой капсуле несколько дней.

Строят калибровочную кривую. Для этого определяет зависимость начальной активности приготовленного перед измерением раствора алкогольдегидрогеназы от концентрации стандартных растворов этанола, Раствор алкогольдегидрогеназы перед употреблением готовят растворением лиофилизированного препарата из расчета 20 мг на 1 мл бидистиллированной воды (активность фермента составляет около 24 МЕ).

Активность фермента определяют следующим образом.

В спектрофотометрическую кювету вносят 1,1 мл М, р Н I О, глицин /Na OH-буферного раствора, 0,1 мл 36 мМ водного раствора

НАД (24 мг/мл), 0,1 мл иоднитротетразолиевого фиолетового с исходной концентрацией 3,8 мг/мл и 0,2 мл раствора этанола с известной концентрацией от 0,75 до 75 мМ, Реакцию инициируют введением 0,2 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Измерение оптической плотности фиксируют при длине волны 510 нм на спектрофотометре или фотоэлектрокалориметре.

Для определения содержания этанола в сыворотке крови определяют активность ал-. когольгидрогеназы аналогично описанному, но вместо раствора этанола с известной концентрацией вводят в кювету 0,2 мл отi она из капсулы. По калибровочной кривой находят концентрацию этанола в кювете.

Затем рассчитывают концентрацию этанола в сыворотке крови по формуле (ЭТАН ОЛ)сыворотки=С A/B, (1) где А — коэффициент разведения отгона в кювете;

С вЂ” концентрация этанола, определенная по калибровочному графику;

 — коэффициент концентрирования при отгоне этанола из сыворотки равный отношению объема взятой сыворотке к объему отгона в капсуле.

Пример 2. Определение этанола в выдыхаемом воздухе.

Для определения этанола в выдыхаемом воздухе последний медленно барботи5 руют через раствор. содержащий 2 мл 0,1 М глицин/NaOH-буфер рН 10, в котором растворены 1 мг алкогольдегидрогенаэы и 2 мг

НАД. Объем барботируемого воздуха равен

1 литру (можно брать 2 или Зл). Затем вводят

10 0,05 мл 5,4 мгlмл иоднитротетразолиевого фиолетового. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 M соляной кислотой. Контролем служит пробирка, содержащая аналогичные реагенты, через которую воз15 дух не барботировали.

Расчет концентрации этанола проводили по формуле (ЗТАНОЛ)—

Ч мкг/л воздуха, (2), где копыт и Оконтр — оптические плотности

25 раствора в опытной и контрольной пробах при 510 нм;

V — общий объем барботируемого через индикаторный раствор выдыхаемого воздуха;

30 6,57 — коэффициент пересчета 1 мкг этанола на 1 л выдыхаемого воздуха.

При наличии этанола в выдыхаемом воздухе раствор окрашивается в красный цвет, окраска которого при фиксации соляной

35 кислотой может сохраняться в течение 4-6 недель при сохранении в темноте при+4 C.

Данные приведены в табл. 1-2.

Предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения этанола

40 до 10 — 12 раз.

55 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности при работе с биологическим материалом, пробу предварительно подвер гают микроперегонке.

Формула изобретения

1. Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выды45 хаемом воздухе путем взаимодействия пробы с раствором, содержащим НАД, алкогольдегидрогенаэу, с последующим фотометрированием, отличающийсятем, что, с целью повышения чувствительности

50 способа, используют алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, в раствор дополнительно вносят иоднитротетраэолий фиолетовый.

1666956

3. Способ по и, 1, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа при работе с выдыхаемым воз-!

Таблица1

Определение концентрации зтанола в выдыхаемом воздухе

Та блица 2

Определение концентрации этанола в цельной кроен, сыворотке крови и гомогенатак тканей предлоаенным способом и способом-прототипом

Концентрация этанола, мкмоль/л или мкмоль(л ткани

Метод олределени

Гомогенат »> ÷>, суслика

Цельная кровь

Гомогенат печен человека

Сь>воротка крови и (э m+8» g m+H

) l. п ет m+H

12 21,4 786+ 14

65>3

1б 6 542+ 25 42 750+ 15 46

49,5 117

534

137

Р<0>0!

Р 0,01

РЮ,О!

Pi0,0l

Алкогольдегидро— геназа зерен пшеницы 12 6,7

66+ 14

20,4

В>9 54 4+ 25 8 3

F40> 01

Р 0,01

РСО, 01

P Ю>01

Составитель Н.Теренина

Редактор Л,Пчолинская Техред М.Моргентал Корректор В. Гирняк

Заказ 2519 Тираж 415 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Алкогольдегидрогенеза печени лов>ади (прототип) духом, пробу барботируют через полученныи раствор, 82+ 15 7, 4 81>

23 21,8