Способ определения активности калпаинов в биологическом материале

Способ определения активности калпаинов в биологическом материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Эта цель достигается тем, что после центрифугирования тканевого гомогената или гемолизата эритроцитов проводят гидрофобное связывание супернатанта с октилсефарозой CL - 4B, отматывают балластные белки и элюируют калпаины 0,5%-ным раствором холата натрия. Активность фермента определяют, используя в качестве субстрата казеин. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1иыйз вя

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4699987/14 (22) 05.06;89 (46) 07.08.91. Бюл. М 29 (71) Рязанский медицинский институт им. акад. И.П. Павлова (72) Е.А. Строев, Е.А. Рязанова и В.Д. Тавинцев (53) 612.015(088.8) (56) Anal. Biochem, 1985, vol, 148, р, 413-423. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАЛПАИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕ P ИАЛ Е

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в клинической практике и для исследовательских работ при изучении различных физиологических и патологических состояний организма человека и животных.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа за счет возможности многократного использования носителя.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Определение активности калпаинов в сердечной мышце.

Сердце крыс гомогенизируют в 8 объемах 20 мМ трис-НС! буфера рН

7,66, содержащего 4 MM динатриевой соли.этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин. К.полученному супернатанту добавляют раствор хлорида натрия до конечной концентрации 0,25 M и наносят на колонку с октил-сефарозой CL-4B (0,9 х 3 см), предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ трис-HCI, 0,25 M

NaCI, 4 мМ ЭЛТА, рН 7,0). Балластные бел!

Ж,, 1668950 А1 (57) Изобретение относится к биохимии.

Цель изобретения — упрощение и ускорение способа. Эта цель достигается тем, что после центрифугирования тканевого гомогената или гемолизата эритроцитов проводят гидрофобное связывание супернатанта с октилсефарозой С1=4В, отмывают балластные белки и элюируют калпаины 0,5 -ным раствором холата натрия. Активность.фермента определяют, используя в качестве субстрата казвин. 1.табл, ки отмывают буфером А. Для элюции калпаинов используют буфер В рН 8,0, содержащий 20 мМ трис+ICI. 4 мМ ЭНТА и 0.50ь хлората натрия. Рабочая скорость 30 мл/ч, объем активной фракции равен 1,5 мл, В инкубационную смесь, содержащую

0,25% щелочно-денатурированного казеина, 20 MM трис-HCI, 5 мМ 2-меркаптоэтанола.. рН 7,5, добавляют раствор хлорида кальция до конечной концентрации 2 мМ и Ch выдерживают в течение 5 мин при ком- 00 натной температуре. Затем добавляют 0

0,4 мл раствора калпаинов и инкубиру- (Я ют при 30 С 30 мин. Реакцию останав- С ливают добавлением 1,5 мл холодной

8 Я,-ной трихлоруксусной кислоты, Смесь центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин.

Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при длине волны 280 нм против контроля, содержащего вместо хлорида кальция 2 мМ ЭДТА.

Пример 2. Определение активности калпаина(Ila эритроцитах,.

Отбирают кровь, используя в качестве антикоагулянта 3 -ный раствор ЭДТА, и

1668950

Составител ь А.Агуреев

Техред М,Моргентал Корректор M. Кучерявая

Редактор И.Шулла

Заказ 2654 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Эритроциты промывают три раза 0,9 jj) "íûì раствором хлорида натрия с 2 мМ ЭДТА.

Для гемолиза используют буфер следующего состава: 20 мМ трис-HCI; 2 мМ ЭДТА, рН 5

7,5, который добавляют к эритроцитам в, соотноаении 1:9 и выдерживают в холо, дильнике 15 мин, Затем гемолизат центри фугируют 40 мин при 16000 g и далее, используют супернатант, с которым про- 10 водят операции по примеру 1. Конечная концентрация хлорида кальция в инкубационной смеси 1 мМ.

Способ дает возможность проводить 15 массовые определения при исследова, тельской работе и в клинике вследствие упрощения техники определения ее удещевления при высокой точности и достаточной чувствительности. 20

В таблице представлены данные, сравнительного анализа известного и

1, предлагаемого способов по чувствительноСТИ И ТОЧНОСТИ.

В известном способе эа единицу активности принимается количество фермента, увеличивающее абсорбцию на 1 ед при 595 нм после 30 мин инкубации при 25 С. В предлагаемом способе активность калпаинов выражена в мкмоль тирозина Ml белка .ч, Формула изобретения

Способ определения активности калпаинов в биологическом материале путем измельчения материала, центрифугирования, помещения супернатанта на хроматографическую колонну, с последующей элюцией калпаинов, инкубацией элюата с субстратом и измерением содержания продуктов гидролиза, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа за счет возможности многократного использования носителя, в качестве носителя в кол о н ке используют октилсефарозу С1=4В, элюцию проводят 0,5 g,-ным раствором холата натрия, при этом связывание калпаинов с носителем проводят при рН 7,0, а элюцию — при рН 8,0.